Optimization of the DNA Extraction Protocol from the Leaves of Fritillaria eduardii Regel

Öz

Fritillaria eduardii Regel is a rare endemic species of high conservation and scientific value, yet molecular studies on this plant are often hampered by difficulties in DNA extraction due to the high content of polysaccharides, phenolic compounds, and secondary metabolites in its tissues. In this study, we tested and optimized a modified CTAB protocol for obtaining high-quality DNA from leaf tissues of F. eduardii. An initial protocol including polyvinylpyrrolidone (PVP) was evaluated, but the DNA yields and purity were inconsistent. Several key modifications were introduced, including exclusion of PVP from the composition, adjustment of buffer composition, replacement of chloroform–octanol with chloroform–isoamyl alcohol, the addition of a CTAB/NaCl purification step, and the use of a high-salt TE buffer for resuspension.Spectrophotometric analysis confirmed that the optimized protocol significantly improved DNA quality and stability. Among the initial nine test samples, only one fully met the optimal purity ratio (A260/A280 = 1.8–2.0), while others showed acceptable but suboptimal values, and three were unsuitable without additional purification. After protocol optimization, over 50 DNA samples were successfully obtained, with concentrations ranging from 548.7 to 4022.9 ng/µl and purity values between 1.80 and 2.09, confirming reproducibility and efficiency.The modified CTAB protocol provides reliable and reproducible DNA suitable for PCR amplification, sequencing, and phylogenetic studies. This approach can be recommended for F. eduardii and potentially adapted for other Fritillaria species rich in polysaccharides and phenolic compounds.

Anahtar Kelimeler

• F. eduardii
• DNA extraction
• CTAB
• spectrophotometric analysis

Proje Numarası

KTMU-BAP-2023.FB.01

Etik Beyan

This work does not contain any human or animal subjects.

Fritillaria eduardii Regel жалбырактарынан ДНК бөлүп алуу протоколун оптималдаштыруу Regel

Öz

Fritillaria eduardii Regel — сейрек кездешүүчү субэндемикалык түр, биологиялык ар түрдүүлүктү сактоо жана илимий изилдөөлөр үчүн чоң мааниге ээ. Бирок, бул өсүмдүктүн ткандарында полисахариддердин, фенолдук кошулмалардын жана экинчилик метаболиттердин көлөмү жогору болгондуктан, ДНК изоляциясы кыйынчылыктарды жаратат. Бул изилдөөдө F. eduardii жалбырак ткандарынан сапаттуу ДНК алуу үчүн модификацияланган CTAB протоколу сыналып оптималдаштырылды. Поливинилпирролидон (PVP) камтыган баштапкы протоколду колдонууда ДНКнын чыгышы жана тазалыгы туруктуу болгон жок. Ошондуктан бир нече өзгөртүүлөр киргизилди: буфердин курамын тууралоо, хлороформ–октанолду хлороформ–изоамил спирти менен алмаштыруу, CTAB/NaCl тазалоо этабын киргизүү жана ДНКны кайра эритүү үчүн туздуу TE буферин колдонуу.Спектрофотометриялык анализдин жыйынтыктары оптималдаштырылган протокол ДНКнын сапатын жана туруктуулугун бир кыйла жогорулатканын тастыктады. Баштапкы тогуз үлгүнүн ичинен бирөө гана оптималдуу тазалык катышына (A260/A280 = 1,8–2,0) дал келди, калгандары жакын, бирок субоптималдуу маанилерди көрсөттү, үч үлгү болсо кошумча тазалоосуз колдонууга жараксыз болду. Протокол оптималдашкандан кийин 50дөн ашык үлгү ийгиликтүү алынып, концентрациялары 548,7–4022,9 нг/мкл диапазонунда, тазалык көрсөткүчтөрү болсо 1,80–2,09 аралыгында болду. Бул протоколдун ишенимдүүлүгүн жана натыйжалуулугун далилдейт.Модификацияланган CTAB протоколу ПЧР амплификациясы, секвенирлөө жана филогенетикалык изилдөөлөр үчүн ылайыктуу, сапаттуу жана туруктуу ДНКны камсыз кылат. Бул ыкма F. eduardii үчүн сунушталат жана полисахариддерге жана фенолдук кошулмаларга бай башка Fritillaria түрлөрүнө да ыңгайланышы мүмкүн.

Anahtar Kelimeler

• F. eduardii
• ДНК экстракциясы
• CTAB
• спектрофотометриялык анализ

Proje Numarası

KTMU-BAP-2023.FB.01

Etik Beyan

Бул изилдөөдө адам жана жаныбар сыналуучу катары колдонулган эмес.

Kaynakça

1. Ambrožová, K., Mandáková, T., Bureš, P., Neumann, P., Leitch, I. J., Koblížková, A., Macas, J., & Lysak, M. A. (2011). Diverse retrotransposon families and an AT-rich satellite DNA revealed in giant genomes of Fritillaria lilies. Annals of Botany, 107(2), 255–268. https://doi.org/10.1093/aob/mcq235
2. Aydın, A., Dede, E., Elmastaş, M., & Tekin, Ş. (2018). Biological Property of Fritillaria imperialis L. Extract. Journal of the Turkish Chemical Society Section A: Chemistry, 5(3), 1043–1050. https://doi.org/10.18596/jotcsa.308895
3. Day, P. D., Berger, M., Hill, L., Fay, M. F., Leitch, A. R., Leitch, I. J., & Kelly, L. J. (2014). Evolutionary relationships in the medicinally important genus Fritillaria L. (Liliaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 80, 11–19. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2014.07.024
4. Karimov, B., Asatulloev, T., Buxorov, G., Turginov, O., Naralieva, N., Azimova, D., Tojibaev, K., & Yusupov, Z. (2024). Analysis of chloroplast genomes of ten central Asian Fritillaria species and their phylogenetic relationships. Nordic Journal of Botany, 2024(12), e04413. https://doi.org/10.1111/njb.04413
5. Kimsanaliev, D., Maraklı, S., & Kaya, Y. (2022). Fritillaria cinsinin ve bu cinsin bir üyesi olan Aygül lalesi’nin (Fritillaria eduardii) dünü, bugünü ve yarını. International Journal of Life Sciences and Biotechnology, 5(3), 627-642.
6. Koçak, M., Karataş, M., Alp, Ş., Baloch, F., & Yildiz, M. (2020). Van Gölü Havzasından Toplanan Terslale (Fritillaria imperialis L.) Genotiplerinde Genetik Farklılığın iPBS Retrotranspozon Markırları ile Belirlenmesi. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tarım Bilimleri Dergisi, 30(2), 398–406. https://doi.org/10.29133/yyutbd.705721
7. Li, Y., Zhang, Z., Yang, J., & Lv, G. (2018). Complete chloroplast genome of seven Fritillaria species, variable DNA markers identification and phylogenetic relationships within the genus. PLOS ONE, 13(3), e0194613. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0194613
8. Lin, G., Li, P., Li, S.-L., & Chan, S.-W. (2001). Chromatographic analysis of Fritillaria isosteroidal alkaloids, the active ingredients of Beimu, the antitussive traditional Chinese medicinal herb. Journal of Chromatography A, 935(1–2), 321–338. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(01)01258-4

9. Rashid, I., & Yaqoob, U. (2021). Traditional uses, phytochemistry and pharmacology of genus Fritillaria—A review. Bulletin of the National Research Centre, 45(1), 124. https://doi.org/10.1186/s42269-021-00577-z
10. Rønsted, N., Law, S., Thornton, H., Fay, M. F., & Chase, M. W. (2005). Molecular phylogenetic evidence for the monophyly of Fritillaria and Lilium (Liliaceae; Liliales) and the infrageneric classification of Fritillaria. Molecular Phylogenetics and Evolution, 35(3), 509–527. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2004.12.023
11. Sennikov, A. N., & Lazkov, G. A. (2013). Taxonomic corrections and new records in vascular plants of Kyrgyzstan, 2.
12. Wang, Y., Liu, J., Zhang, E., Yang, Y., Lu, Q., Zhu, Z., & Li, R. (2025). Metabolite Profiling and Anti-Inflammatory Activities of Fritillaria cirrhosa D. Don Bulbs Derived from Tissue Culture. Molecules, 30(3), 623. https://doi.org/10.3390/molecules30030623
13. Wietsma, W. A., Van Den Berg, R. G., Van Scheepen, J., & Wieringa, J. J. (2011). The nomenclatural history of Fritillaria eduardii and the correct names of its varieties. TAXON, 60(6), 1754–1759. https://doi.org/10.1002/tax.606018
14. Zhang, L., Wang, B., Pan, L., & Peng, J. (2013). Recycling isolation of plant DNA, a novel method. Journal of Genetics and Genomics, 40(1), 45–54.