Molecular Characterization of Dictyocaulus filaria in Sheep from Van Province

Öz

This study aimed to determine the molecular characterization of Dictyocaulus (D.) filaria, known as lungworm, obtained as a result of necropsy examination from sheep brought to the municipal slaughterhouse of Van province for slaughter. This research was carried out between May 2019 and March 2020 in the Van Province Municipality abattoir. After slaughter, 1517 sheep lungs were examined macroscopically. The study material consisted of adult lungworm obtained from the lungs of 140 (9.22%) positive sheep. As a result of microscopic examination of the adult parasites obtained, D. filaria was detected from 56 (3.7%) sheep. DNA isolation of detected D. filaria adults using spin column method was performed with commercial kit (Thermo). In PCR, primers belonging to the 28S rRNA region of lungworm Dictyocaulus filaria (F-GCTACAAAATCGCATACGAACG, R-ACTCCTTAGCGGTTACCGA) were used. In the genomic DNA of D. filaria species used as material in the study, 28S rRNA gene region was amplified by PCR. In the agarose gel, 952 bp length amplicons specific to the 28S rRNA gene region were detected. Next, the amplicon sequence obtained from bidirectional sequence analysis from a PCR product was compared with reference sequences in Genbank by BLAST. By comparing the genotype obtained from the isolate with its exact or closest similarities, phylogenetic tree was created using the Neighbor-Joining method with the MEGA 7 program. In this study, the 952 bp long sequence (MW405935) of D. filaria was found to be 100% similar when compared to the NCBI NO: AM039754.1 sequence found in NCBI BLAST. In conclusion, with this study, the molecular characterization of the 28S rRNA gene region of D. filaria, which is frequently encountered in Van province sheep and known as lungworm, was determined by DNA sequencing analysis. In this study, the molecular identification of adult D. filaria obtained from Van province sheep was made for the first time.

Anahtar Kelimeler

• Dictyocaulus filaria
• Sheep
• Molecular Characterization

Van İli Koyunlarında Dictyocaulus filaria’nın Moleküler Karakterizasyonu

Öz

Bu çalışmada, Van ili Belediye mezbahasına kesim için getirilen koyunlardan nekropsi muayenesi sonucu elde edilen akciğer kıl kurdu olarak bilinen Dictyocaulus (D.) filaria’nın moleküler karakterizasyonunun belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu araştırma Mayıs 2019 ile Mart 2020 tarihleri arasında Van ili Belediye mezbahasında yürütüldü. Kesim sonrası makroskopik olarak 1517 koyun akciğeri muayene edildi. Çalışma materyali pozitif çıkan 140 (%9.22) adet koyun akciğerlerinden elde edilen erişkin akciğer kıl kurtlarından oluşmaktadır. Elde edilen erişkin parazitlerin mikroskopik muayenesi sonucunda 56 (%3.7) adet koyundan D. filaria’a tespit edildi. Tespit edilen D. filaria erişkinleri spin kolon yöntemi kullanılarak DNA izolasyonu, ticari kit (Thermo) ile yapıldı. PCR’da akciğer kıl kurdu olan Dictyocaulus filaria’nın 28S rRNA bölgesine ait primerler (F-GCTACAAAATCGCATACGAACG, R-ACTCCTTAGCGGTTACCGA) kullanıldı. Çalışmada materyal olarak kullanılan D. filaria türünün genomik DNA'sından 28S rRNA gen bölgesi PCR ile amplifiye edildi. Agaroz jelde, 28S rRNA gen bölgesine özgü 952 bç uzunluğunda amplikonlar tespit edildi. Daha sonra, bir PCR ürününden çift yönlü dizi analizinden elde edilen amplikon dizisi, BLAST ile Genbank'taki referans dizilerle karşılaştırıldı. İzolatdan elde edilen genotip tam veya en yakın benzerlikleri ile karşılaştırılarak MEGA 7 programı ile Neighbor-Joining yöntemi kullanılarak filogenetik ağaç oluşturuldu. Yapılan bu çalışmada D. filaria'nın 952 bç uzunluğunda dizisi (MW405935) NCBI BLAST’ta bulunan NCBI NO: AM039754.1 dizisi ile kıyaslandığında %100 benzer olduğu tespit edildi. Sonuç olarak, bu araştırma ile Van ili koyunlarında sıklıkla rastlanılan ve akciğer kılkurdu olarak bilinen D. filaria’nın 28S rRNA gen bölgesinin DNA dizileme analizi yapılarak moleküler karakterizasyonu tespit edildi. Bu çalışma ile Van ili koyunlarından elde edilen erişkin D. filaria’nın ilk kez moleküler identifikasyonu yapıldı.

Anahtar Kelimeler

• Dictyocaulus filaria
• Koyun
• Moleküler Karakterizasyon

Kaynakça

1. Addis M, Fromsa A, Ebuy Y 2011. Study on the prevalence of lungworm infection in small ruminants in Gondar Town. Vet. Res. 4:85-89.
2. Alasaad S, Morrondo P, Dacal-Rivas V, Soriguer RC, Granados JE, Serrano E, Zhu XQ, Rossi L, Pérez JM 2009. Bronchopulmonary nematode infection of Capra pyrenaica in the Sierra Nevada masif. Vet. Parasitol. 164:2-4.
3. Bağcı Ö, Bıyıkoğlu G 2003. İstanbul’da değişik kombinalarda kesilen koyunlarda akciğer kılkurtlarının yayılışı. Türkiye Parazitol. Derg. 27:139-43.
4. Bogale B, Ebre A, Melaku A 2012. Ovine lungworm infection: Prevalence, species composition and associated risk factors in Dessie Zuria district. Afr. J. Basic. Appl. Sci. 4(3): 73-76.
5. Borak M 2013. Verminöz pnömonili koyunlarda indüklenebilir nitrik oksit sentaz (inos) protein ekspresyonunun immunhistokimyasal olarak belirlenmesi [Yüksek Lisans Tezi]. Van: Yüzüncü Yıl Üniversitesi.
6. Borji H, Azizzadeh M, Ebrahimi M, Asadpour M 2012. Study on small ruminant lungworms and associated risk factors in northeastern Iran. Asian. Pac. J. Trop. Med. 853-856.
7. Celep A, Açıcı M, Çetindağ M, Coşkun ŞZ, Gürsoy S 1990. Samsun yöresi sığırlarında helmintolojik araştırmalar. Etlik Vet. Mikrobiyol. Derg. 6:117-30.
8. Celep A, Açıcı M, Çetindağ M, Gürbüz İ 1995. Samsun yöresi koyunlarında paraziter epidemiyolojik çalışmalar. Türkiye Parazitol Derg. 19:290-6.

9. Çetindağ M 1993.Samsun yöresi koyunlarında akciğer nematodları. Türkiye Parazitol. Derg. 17:88-92.
10. Değer S, Akgül Y 1991. Van ili Bardakçı köyünde bulunan endoparazitlerin epidemiyolojisi. Yüzüncü Yıl Üniv. Vet. Fak. Derg. 2,1-2:11-22.
11. Değer S, Biçek K, Akdemir C, Taş Z 2000. Van Belediye mezbahasında kesilen koyunlarda akciğer kılkurtlarının yayılışı. Yüzüncü Yıl Üniv. Vet. Fak. Derg. 27:215-36.
12. Denbarga Y, Mekonnen A, Abebe R, Sheferaw D 2013. Prevalence of lungworm infection in sheep around Bahir-Dar Town. APG. 4 (2):54-58.
13. Dik B, Sevinç F, Güneği HB 1993. Konya Et ve Balık Kombinası’nda kesilen koyunlarda akciğer kılkurtlarının yayılışı. Türk Vet. Hek. Derg. 5(1):39-42.
14. Dik B, Sevinç F, Sevinç M 1995. Konya yöresi koyunlarında akciğer kıl kurtlarının yayılışı. Veterinarium. 6(1-2): 79-81.
15. Doğanay A, Burgu A, Toparlak M 1989. Ankara yöresinde koyunlarda Metastrongylose. Etlik Vet. Mikrobiyol. Derg. 6(5): 99-113.
16. Emir H 2013. Anadolu yaban koyunlarında (Ovis gmelinii anatolica) sindirim sistemi helmintleri. [Doktora Tezi]. Ankara. Ankara Üniversitesi.
17. Epe C, Samson-Himmelstjerna GV, Schnieder T 1997. Differences in a ribosomal DNA sequence of lungworm species (Nematoda: Dictyocaulidae) from fallow deer, cattle, sheep and donkeys. Res. Vet. Sci. 62:17-21.
18. Eyob E, Matios L 2013. The prevalence and risk factors associated with ovine lungworm infestation in the Asella province Central Ethiopia. J. Parasitol. Vector. Biol. 25-30.
19. Gargili A 1995. Trakya’da kıvırcık koyunlarında akciğer nematodlarının yayılışı. [Doktora Tezi]. İstanbul. İstanbul Üniversitesi.
20. Girişgin O, Şenlik B, Girişgin AO, Akyol V 2008. Studies on sheep lungworms in Bursa province of Turkey: Determination of prevalence and relationships between larval output and parasite burden in the lungs. Pakistan J. Zool. 40(5):365-9.
21. Gjoni N, Biba N, Bizhga B, Laçi D, Zalla P, Sherko E, Xhemollari E 2013. The bronchopulmonary strongylats in goats of Elbasan district. Anglisticum Journal. 2(4):353-361.
22. Güralp N 1952. Anadolu koyunlarında görülen Metastrongylidae nevilerine dair sistematik araştırmalar. Ankara Üniv. Vet. Fak. Yayınları, Ankara.
23. Güralp N 1981. Helmintoloji. 2. Baskı, Ankara Üniv Vet Fak, Ankara Üniversitesi Basımevi, Ankara. 368: 338-65.
24. Hendrix CM 1997. Laboratory Procedures for Veterinary Technicians, Third Edition, Pratt PW. ed. USA: VMD Mosby, Inc.
25. Kırcalı Sevimli F, Kozan E, Köse M, Eser M 2006. Dışkı muayenesine göre Afyonkarahisar ili koyunlarında bulunan helmintlerin yayılışı. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg. 53: 137-40.
26. Köse M, Erdoğan M, Kartal K 2017. Afyonkarahisar Yöresi Koyun Akciğer Kıl kurdu Türlerinin Moleküler Karakterizasyonu. Atatürk Üniversitesi Vet. Bil. Derg. 2(3): 283-8.
27. Kuchboev AE, Karimova RR, Ruziev BK, Azimov DA 2012. Ecological aspects of nematodes of the family Protostrongylidae, parasites of bovidae. Sci. Parasitol. 13(1):17-25.
28. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food (MAFF) 1971. Manuel of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques, London: HMSO. Technical Bulletin. 18.
29. Soulsby EJL 1986. Helminths, artropods and protozoa of domesticated animals. 7th Ed.,Bailliere Tindall, London. 263 (8): 271-6.
30. Taşan E, Köroğlu E, Altaş MG 1997. Elazığ bölgesinde akciğer kılkurtlarının yayılışı. F. Ü. Sağlık Bil. Derg.11: 273-6.
31. Taylor MA, Coop RL, Wall R 2007. Veterinary Parasitology. Third edition, Blackwell Publishing, UK. 197.
32. Terefe Y, Tafess K, Fekadie G, Kebede N 2013. Prevalence of lungworm infection in small ruminants in North Gondar zone, Amhara National Regional State, Ethiopia. J. Parasitol. Vector. Biol. 5(4):40-45.
33. Thienpont D, Rochette F, Vanparijs OFJ 1986. Diagnosis Helminthiasis by Coprological Examination. Second Edition, Janssen Research Foundation, Belgiu.
34. Umur Ş, Köroğlu E, Güçlü F, Tınar R 2006. Helmintoloji, Nematoda. Ed. Tınar R, Nobel Yayın Dağıtım, Ankara. 965:213-461.
35. Umur Ş, Özkan MÖ 1998. Kars yöresi sığır ve koyunlarında akciğer kılkurtları. Turkiye Parazitol. Derg. 22:88-92.
36. Yıldırım A, İça A 2005. Kayseri yöresinde koyunlarda akciğer kılkurdu enfeksiyonlarının prevalansı. Erciyes Üniv. Vet. Fak. Derg. 2(2): 73-8.
37. Yıldız K, Aydenizöz M 2001. Kırıkkale koyunlarında helmintlerin yayılışı. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg. 48: 179-82.
38. Yıldız, K 2006. Prevalence of lungworm infection in sheep and cattle in the Kirikkale province. Turkiye Parazitol. Derg. 30: 190-193.