Detection and characterization of some important Prunus viruses infecting almond trees in Adıyaman province of Turkey by DAS-ELISA and RT-PCR analysis

Abstract

Aims: In this study, it was aimed to investigate the presence of apple mosaic virus (ApMV), prunus necrotic ring spot virus (PNRSV), prune dwarf virus (PDV), plum pox virus (PPV) and apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) in almond trees in Adıyaman province by Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (DAS-ELISA) and Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) methods, to analyse the phylogenetic relationships of obtained virus isolates.

Methods and Results: Symptomatic and asymptomatic plant samples were collected from almond trees from Adıyaman province. All samples were tested by DAS-ELISA and RT-PCR methods. As a result of DAS-ELISA and RT-PCR analysis, 34 samples were found to be infected only with PDV and other viruses tested were not detected in the samples. PDV isolates obtained by RT-PCR were directly sequenced and then nucleotide sequences were phylogenetically analyzed with each other and compared with other PDV isolates, deposited in GenBank. Adıyaman-PDV isolates were clustered in a same group with a high homology and differed from other PDV isolates retrieved from the GenBank. This is the first report of the presence of PDV in almond plantations in Adıyaman province. 15 of the PDV almond isolates were registered in GenBank with the accession numbers MW357407-MW357421.

Conclusions: The presence of prune dwarf virus (PDV) in almond trees in Adıyaman has been proven for the first time by this study as a result of both DAS-ELISA and RT-PCR tests. The fact that the almond trees in Adıyaman are infected with PDV with an infection rate of 30.90% which makes it necessary to take measures during the establishment of the almond plantations in the region. Since ACLSV, ApMV, PNRSV and PPV are not detected in the tested almond samples, so in future studies, it is recommended to increase the number of samples by surveying larger areas to make new tests using different virus specific primer pairs.

Significance and Impact of the Study: Detection and characterization of important prunus viruses on almonds in Adıyaman province has been investigated for the first time.

Keywords

• Almond
• virus
• DAS-ELISA
• RT-PCR
• sequence analysis

Adıyaman ili badem ağaçlarını enfekte eden önemli Prunus virüslerinin DAS-ELISA ve RT-PCR analizleri ile saptanması ve karakterizasyonu

Öz

Amaç: Bu çalışmada, Adıyaman ili genelinde yetişen badem ağaçlarında apple mosaic virus (ApMV), prunus necrotic ring spot virus (PNRSV), prune dwarf virus (PDV), plum pox virus (PPV) ve apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV)’lerinin Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (DAS-ELISA) ve Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) yöntemleriyle belirlenmesi, elde edilen virüs izolatlarının filogenetik ilişkilerinin ortaya konulması amaçlanmıştır.

Yöntemler ve Bulgular: Adıyaman ilinde yetişen badem ağaçlarından simptomlu ve simptomsuz bitki örnekleri toplanmıştır. Toplanan tüm örnekler DAS-ELISA ve RT-PCR yöntemleri ile testlenmiştir. DAS-ELISA ve RT-PCR analizi sonucunda 34 örneğin yalnız PDV ile enfekteli olduğu saptanmış, ancak testlenen örneklerde diğer virüsler bulunmamıştır. RT-PCR ile elde edilen PDV izolatları doğrudan sekanslanmıştır. Nükleotid sekansları birbiriyle ve GenBank'ta depolanan diğer PDV izolatları ile karşılaştırılarak filogenetik olarak analiz edilmiştir. Adıyaman PDV badem izolatlarının filogenetik ağaçta yüksek homolojiyle aynı grupta yer aldığı, GenBank’a kayıtlı diğer PDV izolatlarından ise farklı bir grupta kümelendiği belirlenmiştir. Bu çalışma Adıyaman ili badem ağaçlarında PDV’nin saptanması konusundaki ilk çalışmadır. PDV badem izolatlarından 15 tanesi MW357407-MW357421 erişim numaraları ile GenBankası’na kaydedilmiştir.

Genel Yorum: Adıyaman'da yetişen badem ağaçlarında prune dwarf virus (PDV)’unun varlığı, hem DAS-ELISA hem de RT-PCR testleri sonucunda ilk kez bu çalışma ile kanıtlanmıştır. Adıyaman'da yetişen badem ağaçlarının %30,90 oranında PDV ile bulaşık olması, bölgede badem plantasyonlarının kurulması sırasında önlem alınması gerektiğini göstermektedir. Test edilen badem örneklerinde ACLSV, ApMV, PNRSV ve PPV tespit edilmediğinden, ileride yapılacak çalışmalar ile daha geniş alanları tarayarak örnek sayısının artırılması ve virüslere özgü farklı primer çiftleri kullanılarak yeni testlerin yapılması gerekmektedir.

Çalışmanın Önemi ve Etkisi: Adıyaman ilinde yetişen badem ağaçlarında önemli Prunus virüslerinin tespiti ve karakterizasyonu ilk kez yapılmıştır.

Anahtar Kelimeler

• badem
• virüs
• DAS-ELISA
• RT-PCR
• sekans analizleri

Kaynakça

1. Anonim (2019) TUİK Bitkisel Üretim İstatistikleri. http://www.tuik.gov.tr/bitkiselapp/ bitkisel.zul (Erişim tarihi: 10.06.2020)
2. Bertozzi T, Alberts E, Sedgley M (2002) Detection of prunus necrotic ringspot virus in almond: effect of sampling time on the efficiency of serological and biological indexing methodologies. Aust J Exp Agr 42: 207-210.
3. Bonfield JK, Smith K, Staden R (1995) A new DNA sequence assembly program. Nucleic Acids Res 23: 4992-4999.
4. Clark MF, Adams AN (1977) Characteristics of the micro-plate method of Enzime Linked Immuno Sorbent Assay for the detection of plant viruses. J Gen Virol 34: 475-483.
5. Clark MF (1981). Immunosorbent assay plant pathology. Annu Rev Phytopathol 19: 83-106.
6. Çağlayan K, Gazel M, Hadidi A (1998) Virus and virus-like diseases of stone fruits in the eastern Mediterranean of Turkey. Acta Hortic 472(2): 527-529.
7. Digiaro M, Savino V, Di Terlizzi B (1992) Ilarviruses in apricot and plum polen. Acta Hortic 309: 93-98.
8. Dunez J (1988) Situation of virus and virus-like diseases of stone fruits in the Mediterranean and Near east region. In: Fruit crop sanitation in the Mediterranean and Near East region: status and requirements. UNDP/FAO Publication, France. pp. 226-275.

9. Dunez J (2000) Virus and virus-like diseases of stone fruits. Options Mediterraneennes Serie B: Studies and Reasearch Number 35, Mediterranean Agronomic Institute of Bari, Bari. pp 67.
10. Elibüyük IÖ, Erdiller G (1998) Investigation on the causes of fruit droping of apricot and plum trees ın Ankara province. J Turk Phytopath 17(3): 98.
11. Gazel MH (1997) Hatay Bölgesi Prunus Türlerindeki Virüs Hastalıklarının ELISA Ve Biyolojik Yöntemlerle Tanılanması. Yüksek Lisans Tezi, Mustafa Kemal Universitesi, Fen Bil. Ens., Bitki Koruma ABD, 55 s.
12. Gazel M, Tunç B, Çağlayan K (2018) Hatay ve Tekirdağ illeri bağ alanlarında odun dokusunda deformasyona (Rugose Wood) neden olan virüslerin serolojik ve moleküler yöntemlerle saptanması ve karakterizasyonu. Mustafa Kemal Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 23: 181 – 187.
13. Gazel M, Serçe CU, Öztürk H, Çağlayan K (2018) Farklı armut dokularında ve örnekleme zamanında ‘Candidatus Phytoplasma pyri’’nin PCR-RFLP analizleri ile saptanması. Mustafa Kemal Üniversitesi Tarım Bilimleri Dergisi, 25: 406-412.
14. Gazel MH, Çağlayan K (1998) Hatay Bölgesi Prunus Türlerindeki Virüs Hastalıklarının ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Ve Biyolojik Yöntemlerle Tanılanması. VIII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi, Eylül 21-25, Ankara, Türkiye pp 322-327.
15. Gilmer RM, Nyland G, Moore JD (1976) Prune dwarf virus, In: Virus diseases and noninfectious disorders of stone fruits in North America. (Ed. Fulton RW) U.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service Press, Washington. pp 179-190.
16. Gümüş M, Hepaksoy S, Paylan İC, Eroğul D, Erkan S (2007) Sert çekirdekli meyve türlerinde sertifikalı fidan üretimine yönelik çalışmalar. Türkiye II. Bitki Koruma Kongresi, Ağustos 27-29, Isparta, Türkiye pp 109.
17. Kahn RP (1976) Quarantine and the detection of stone fruit viruses in plant importations, In: Virus Diseases and Noninfectious Disorders of Stone Fruits in North America. (Ed. Fulton RW) U.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service Press, Washington. pp 23-32.
18. Karabacak M (2012). Trakya Bölgesi’nde badem (Prunus dulcis) ağaçlarında görülen virüs hastalıklarının saptanması. Yüksek Lisans Tezi, Namık Kemal Üniversitesi, Fen Bil. Ens., Bitki Koruma ABD, 44 sayfa.
19. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K (2018) MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol Biol Evol 35:1547-1549.
20. Menzel W, Jelkmann W, Maiss E (2002) Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. J Virol Methods 99: 81-92.
21. Milusheva SA, Borisova AZ (2005) The incidence of prunus necrotic ringspot and prune dwarf viruses in Prunus species in South Bulgaria. Biotechnol Biotechnol Equip 19: 42-45.
22. Myrta A, Di Terlizzi B, Savino V, Martelli GP (2003) Virus diseases affecting the Mediterranean stone fruit industry: a decade of surveys, In: Virus and Virus-like Diseases of Stone Fruits with Particular Reference to the Mediterranean Region, (Eds. Myrta A. Di Terlizzi B, Savino V), Options Méditerranéennes: Série B. Etudes et Recherches; n. 45, Bari. Pp 15−23.
23. Nemeth M (1986) Virus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit trees, Springer Netherlands Publishing, Budapest, pp 841.
24. Olmos A, Cambra M, Dasi MA, Candresse T, Esteban O, Gorris MT, Asensio M (1997) Simultaneous detection and typing of plum pox potyvirus (PPV) isolates by heminested-PCR and PCR-ELISA. J Virol Methods 68: 127–137.
25. Öztekin V (2006) K.S.Ü. Sekamer koleksiyon parselindeki badem ağaçlarında virüs hastalıklarının serolojik teşhisleri ve kontrolü. Yüksek Lisans Tezi, Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi, Fen Bil. Ens., Bitki Koruma ABD, 43 s.
26. Predajňa L, Sihelská N, Benediková D, Šoltys K, Candresse T, Glasa M (2017) Molecular characterization of prune dwarf virus cherry isolates from Slovakia shows their substantial variability and reveals recombination events in PDV RNA3. Eur J Plant Pathol 147: 877–885.
27. Rosner A, Shiboleth Y, Spiegel S, Krisbai L, Kölber M (1998) Evaluating the use of immunocapture and sap-dilution PCR for the detection of prunus necrotic ringspot virus. In: 17 th. International Symposium On Fruit Tree Virus Diseases. Ed. A. Hadidi, Acta Hortic 472: 227-233.
28. Rott ME, Jelkmann W (2001) Characterization and detection of several filamentous viruses of cherry: adaptation of an alternative cloning method (DOP-PCR) and modification of an RNA extraction protocol. Eur J Plant Pathol 107: 411-420.
29. Saitou N, Nei M (1987) The Neighbor-Joining Method—a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4:406–425.
30. Sertkaya G, Çağlayan K, Ulubaş Ç (2004) Detection of some viruses of stone fruits in mother plant blocks in Eastern Mediterranean Region of Turkey. Acta Hortic 657: 127-132.
31. Sipahioğlu HM, Myrta A, Abou-Ghanem N, Di Terlizzi B, Savino V (1999) Sanitary status of stone fruit trees in East Anatolia (Turkey) with particular reference to apricot. OEPP/EPPO Bulletin, France. pp 439-442.
32. Sipahioğlu HM, Usta M, Ocak M (2007) Virüsten ari sert çekirdekli meyve fidanı üretimi. TUBİTAK Proje No: TOVAG 1050641.
33. Ulubaş Serçe Ç, Ertunç F, Öztürk A (2009) Identification and genomic variability of prune dwarf virus variants infecting stone fruit trees in Turkey. J Phytopathol, 157(5): 298-305.
34. Yavuz Ş, Gazel M, Çağlayan K (2019) Adana ve İçel illerinde elma bahçelerinde elma çoklu sürgün fitoplazma hastalığı (Candidatus Phytoplasma mali)’nın varlığının belirlenmesi. Mustafa Kemal Üniversitesi Tarım Bilimleri Dergisi, 24: 15-20.
35. Yegül M (2017) Doğu Akdeniz Bölgesinde badem ve ceviz ağaçlarında görülen virüs hastalıklarının saptanması, karakterizasyonu ve bazı çeşit davranışlarının belirlenmesi. Doktora Tezi, Çukurova Üniversitesi, Fen Bil. Ens., Bitki Koruma ABD, 197s.
36. Yıldızgördü KÇ, Çalı S (1994) Occurrence and detection of virus and virus-like diseases of plum and apricot trees in the eastern Mediterranean area. Proceedings of 9th Congress of Mediterranean Phytopathological Union, September 18-24, Aydın, Turkey. pp 551-553.