History of the Ziehl-Neelsen Staining Method

Öz

For over a century, microscopic examination used for the detection of acid fast bacteria bacilli in clinical specimens has been a rapid, simple, inexpensive, and easily applicable method in diagnostic laboratories at every level. The aim of this review is to explore the development process of the Ziehl-Neelsen (ZN) staining method used in microscopic examination for the diagnosis of tuberculosis and to investigate the contributions made during this process. On March 24, 1882, Robert Koch announced that he could stain tuberculosis bacilli by allowing smear preparations to stand in warm methylene blue for 20-24 hours. Due to the use of Bismarck brown as a counterstain in Koch's staining, tuberculosis bacilli were stained blue, while other bacteria were stained brown. The first suggestion to improve Koch's staining came from Paul Ehrlich in May 1882. Ehrlich developed a decolorization step using a mineral acid to make bacteria other than tuberculosis bacilli lose their stain. Additionally, he used fuchsin instead of methylene blue as a dye and aniline oil as a fixative. Prof. Rindfleisch shortened the staining time by heating the smear preparation from below instead of using hot dye. In August 1882, Franz Ziehl changed Ehrlich's method by using carbolic acid as a fixative instead of aniline oil. In July 1883, Friedrich Neelsen combined improvement efforts, reporting a method using carbolfuchsin as the primary dye, methylene blue as the counterstain, sulfuric acid for decolorization, and heating from below for 5-10 minutes, resulting in tuberculosis bacilli being stained red and other bacteria being stained blue. This staining method, which has been used to the present day, was developed through the efforts of at least five scientists.

Anahtar Kelimeler

• tuberculosis
• Ehrlich
• Ziehl
• Neelsen
• staining

Erlich-Ziehl-Neelsen Boyama Yönteminin Tarihçesi

Öz

Yüzyılı aşkın süredir klinik örneklerde aside dirençli bakterilerin saptanması amacıyla kullanılan mikroskobik inceleme her düzey tanı laboratuvarında uygulanabilen hızlı, basit, ucuz ve kolay bir yöntemdir. Bu derlemenin amacı tüberküloz tanısı için mikroskobik incelemede kullanılan EZN boyama yönteminin geliştirilme süreci ve bu süreçte katkısı olanların araştırılmasıdır. İlk kez 24 Mart 1882'de Robert Koch, yayma preparatları sıcak metilen mavisinde 20-24 saat bekleterek tüberküloz basillerini boyayabildiği duyurmuştur. Koch’un boyamasında zıt boya olarak kullanılan bismark kahverengisi nedeni ile tüberküloz basilleri mavi, diğer bakteriler kahverengi boyanıyordu. Koch'un yönteminin iyileştirilmesi için ilk öneri, Mayıs 1882’de Paul Ehrlich'ten gelmiştir. Ehrlich tüberküloz basili dışındaki bakterilerin boyayı bırakmaları için bir mineral asit kullanarak renksizleştirme basamağını geliştirmiş, ayrıca boya olarak metilen mavisi yerine fuksin, boya sabitleyici olarak anilin yağını kullanmıştır. Prof. Rindfleisch ise sıcak boya kullanmak yerine, üzerine boya koyulan yayma preparatı alttan ısıtılarak boyama süresini kısaltmıştır. Ağustos 1882’de Franz Ziehl, boya sabitleyici olarak anilin yağı yerine karbolik asit kullanarak Ehrlich'in yöntemini değiştirmiştir. Temmuz 1883’de Friedrich Neelsen iyileştirme çalışmalarını birleştirerek birincil boya olarak karbolfuksin, zıt boya olarak metilen mavisi, renksizleştirme için sülfirik asit ve sıcaklık olarak alttan ısıtmanın kullanıldığı yöntem ile 5-10 dakikada tüberküloz basillerinin kırmızı diğer bakterilerin mavi olarak boyadığını bildirmiştir. Günümüze kadar kullanılmakta olan bu boyama yöntemi en az beş bilim adamının çabaları sonucu geliştirilmiştir.

Anahtar Kelimeler

• tüberküloz
• Ehrlich
• Ziehl
• Neelsen
• boyama

Kaynakça

1. European Centre for Disease Prevention and Control. Handbook on tuberculosis laboratory diagnostic methods in the European Union – Updated 2022. Stockholm: ECDC; 2023.
2. Cambau E, Drancourt M. Steps towards the discovery of Mycobacterium tuberculosis by Robert Koch, 1882. Clin Microbiol Infect 2014;20(3):196-201.
3. Villemin JA. Etudes sur la tuberculose: preuves rationnelles et experimentales de sa specificite et de son inoculabilite. Paris: J.-B. Bailliere; 1868.
4. Weigert C. Farbung der Bacterien mit Anilinfarben. Breslau: Universitat Breslau; 1875.
5. Koch R. Die Aetiologie der Tuberkulose. Berliner klinische Wochenschrift 1882;15:221–30.
6. Bishop PJ, Neumann G. The history of the Ziehl-Neelsen stain. Tubercle, 1970;51(2):196-206.
7. Jay VA. Portrait in History: Paul Ehrlich. Arch Pathol Lab Med 2001;125:724-5.
8. Ehrlich PV. Aus dem Verein fur innere Medizin zu Berlin. Sitzung vom, 1. Mai 1882. Deutsche Medizinische Wochenschrift 1882;8:269.

9. Ehrlich P. Beitrage zur Theorie der Bacillenfarbung. Charite-Annalen 1886;11:123.
10. Editorial note. The bacillus of tubercle. Br Med J 1885;1(1256):169-171.
11. Ziehl F. Zur Farbung des Tuberkelbaclilus. Dtsch Med Wochenschr 1882;8(33):451.
12. Ziehl F. Zur Lehre von den Tuberkelbacillen insbesondere tiber deren Bedeutung fur Diagnose und Prognose. Dtsch Med Wochenschr 1883;9(5):62-67.
13. Ziehl F. Ueber die Zuverlässigkeit von Impfungen in die vordere Augenkammer mit tuberculösen Substanzen. Dtsch Med Wochenschr 1883;9(17):247.
14. Neelsen F. Ein casuistischer Beitrag zur Lehre von der Tuberkulose. Centralblatt fur die medicinischen Wissenschaften 1883;28:497-501.
15. Neelsen F. Grundriss der pathologisch-anatomischen Technik fur praktische Arzte und Studierende. Ferdinand Enke: Stuttgart; 1892. pp:66.