Changes in Phosphorylation Levels of PKA, AKT(PKB) and PKC Targeted AKT Substrates Upon EGF Stimulation in Metastatic Breast Cancer Cells

Protein kinaz B (PKB/AKT), hücre metabolizması, büyüme, çoğalma ve tümör invazyonu dahil olmak üzere çok çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçleri düzenleyen fosfatidilinositol-3-kinaz (PI3K)/AKT sinyal yolağının temel düzenleyicisidir. AKT enzimi, EGF gibi hücresel uyarıcı moleküller tarafından aktive edilebilen bir serin/treonin kinazdır. Aktive AKT enzimi, hedef substratlarını RxRxxS/T konsensus dizisine bağlanarak fosforile eder. Bazı AKT hedefleri, farklı serin/treonin kinazlar tarafından benzer rezidulardan fosforile edilebilmektedir. Bu substratlar üzerinde yapılan birçok çalışma, sinyal yolakları arası etkileşimi sağlayan ortak moleküllerin ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi için değerli bilgiler sunmaktadır. Bu bağlamda söz konusu çalışmada, EGF uyarımına bağlı olarak MDA-MB-231 üçlü negatif metastatik meme kanseri hücrelerinde, AKT substrat fosforilasyonlarını mimik eden PKA, PKB(AKT) ve PKC hedefli yeni moleküllerin belirlenmesi amaçlanmıştır. AKT substratlarının fosforilasyon düzeyleri Western blot analizi ile değerlendirildi. Elde edilen sonuçlara göre, PKA, PKB ve PKC inhibitörlerinin varlığında ve EGF uyarımı ile birlikte 30 kDa ağırlığında bir fosfo-proteininin (pp30), AKT substrat fosforilasyon düzeyinin değiştiği saptandı. EGF uyarımına bağlı olarak, beklendiği üzere AKT substratlarının fosforilasyon düzeyleri artarken, inhibitörler bu fosforilasyonları baskılamaktadır. Dikkat çekici bir şekilde, PKC inhibitörü varlığında pp30’un fosforilasyon düzeyinin, EGF uyarımına rağmen kontrole kıyasla azaldığı belirlendi. Bu sonuç, pp30’un hücresel regülasyonunun PKC tarafından AKT ile aynı bölgeden gerçekleşebileceğini ortaya koymaktadır. Çalışmamızdaki metodoloji, AKT ile PKC sinyal yolakları arasındaki etkileşimde rolü olabilecek yeni potansiyel düzenleyicilerin tanımlanabilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir. Ancak, bu etkileşimin ne yönde olduğunu açıklayabilmek için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır

Protein kinase B (PKB/AKT) is a crucial regulator of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT signaling pathway, which regulates a wide range of physiological and pathological processes, including cell metabolism, growth, proliferation, and tumor invasion. The AKT enzyme is a serine/threonine kinase that can be activated by cellular stimuli such as EGF. Once activated, the AKT enzyme phosphorylates its target substrates by binding to the RxRxxS/T consensus sequence. Some AKT targets can be phosphorylated at similar residues by different serine/threonine kinases. Numerous studies on these substrates provide valuable insights into common molecules facilitating cross-talk between signaling pathways and the identification of new therapeutic targets. In this study, we aimed to identify novel molecules that target PKA, PKB (AKT), and PKC and mimic AKT substrate phosphorylation in EGF-stimulated MDA-MB-231 triple-negative metastatic breast cancer cells. Phosphorylation levels of AKT substrates were assessed using Western blot analysis. According to the results, the phosphorylation level of a 30 kDa phosphoprotein (pp30) varied in the presence of PKA, PKB, and PKC inhibitors, as well as upon EGF stimulation. As expected, phosphorylation levels of AKT substrates increased with EGF stimulation, while the inhibitors suppressed these phosphorylations. Interestingly, in the presence of the PKC inhibitor, the phosphorylation level of pp30 was found to be decreased compared to the control, despite EGF stimulation. This suggests that cellular regulation of pp30 by PKC might occur through the same region as AKT. Our methodology demonstrates the potential to identify new regulators that may play a role in the interaction between AKT and PKC signaling pathways. However, further studies are required to elucidate the specifics of this interaction.