Rutin Klinik Laboratuvarlarda Gram-Pozitif Bakteriler İçin MALDI-TOF MS Ön İşlemi: Formik Asit Tanımlamayı Gerçekten İyileştiriyor mu?

Öz

Gram-pozitif bakterilerin matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon–uçuş zamanı kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) ile doğru tanımlanması, hücre duvarlarının karmaşık yapısı nedeniyle bazı durumlarda sınırlı olabilmektedir. Bu çalışmada, rutin bir klinik mikrobiyoloji laboratuvarında MALDI-TOF MS ile bakteri tanımlama performansı üzerine plak üzerinde uygulanan formik asit (FA) ön işleminin etkisi değerlendirilmiştir. Çalışmaya, benzersiz toplam 148 Gram-pozitif klinik izolat dahil edilmiştir. İzolatlar iki farklı hazırlama yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir: doğrudan transfer (DT) yöntemi ve plak üzerinde FA ön işlemi. Tanımlama skorları karşılaştırılırken, özellikle yüksek güvenilirlikte tür düzeyinde tanımlama (log skor ≥ 2,0) kriteri esas alınmıştır. İstatistiksel analizlerde Wilcoxon işaretli sıralar testi ve McNemar testi kullanılmıştır. Genel tanımlama oranı, FA ön işlemi uygulanan örneklerde DT yöntemine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur (%99,3 ve %79,7). Tür düzeyinde tanımlama elde edilen izolat oranı DT yöntemi ile %27,1 iken, FA ön işlemi ile bu oran %76,2’ye yükselmiştir. Tüm izolatlar için ortalama MALDI-TOF MS log skorları, FA ön işlemi ile DT yöntemine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek saptanmıştır (2,104 ± 0,186 ve 1,861 ± 0,265; p < 0,001). Ayrıca, DT yöntemi ile halihazırda tür düzeyinde tanımlanmış izolatlarda dahi FA ön işlemi sonrasında ortalama log skorlarında anlamlı bir artış gözlenmiştir (p = 0,001). En belirgin iyileşme, özellikle koagülaz-negatif stafilokoklar olmak üzere Staphylococcus türlerinde izlenmiş; DT ve FA destekli tanımlamalar arasında tür düzeyinde tam uyum saptanmıştır. Sonuç olarak, plak üzerinde uygulanan formik asit ön işlemi, rutin MALDI-TOF MS uygulamalarında Gram-pozitif bakterilerin tanımlanma doğruluğunu ve tanısal güvenilirliği anlamlı ölçüde artırmaktadır. Bu bulgulardan yola çıkarak, FA ön işleminin DT log skoru < 2,0 olan Gram-pozitif izolatlara refleks olarak uygulandığı; stafilokoklar (özellikle koagülaz-negatif türler) ve nadir karşılaşılan Gram-pozitif organizmalar için ise birincil olarak önerildiği, skor temelli ve tür bilinçli pragmatik bir tanı algoritması önermekteyiz.

Anahtar Kelimeler

• Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI)
• Gram pozitif bakteriler
• mikrobiyoloji
• laboratuvar teknikleri;klinik
• stafilokok

Etik Beyan

Çalışma, İstanbul Başakşehir Çam ve Sakura Şehir Hastanesi Girişimsel Olmayan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Karar No: 368, Tarih: 23.08.2023).

MALDI-TOF MS Pretreatment for Gram-Positive Bacteria in Routine Clinical Laboratories: Does Formic Acid Really Improve Identification?

Öz

Accurate identification of Gram-positive bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) may be limited by the complex structure of their cell walls. This study evaluated the impact of on-plate formic acid (FA) pretreatment on MALDI-TOF MS identification performance in a routine clinical microbiology laboratory. A total of 148 non-repetitive Gram-positive clinical isolates were analyzed using two preparation methods: direct transfer (DT) and on-plate FA pretreatment. Identification scores were compared with an emphasis on high-confidence species-level identification (log score ≥ 2.0). Statistical analyses were performed using the Wilcoxon signed-rank and McNemar tests. Overall identification rates were significantly higher with FA pretreatment than with DT (99.3% vs. 79.7%). The proportion of isolates achieving species-level identification increased from 27.1% with DT to 76.2% with FA pretreatment. Mean MALDI-TOF MS log scores for all isolates were significantly higher with FA (2.104 ± 0.186) than with DT (1.861 ± 0.265; p < 0.001). Notably, FA pretreatment also resulted in a significant increase in mean log scores among isolates that had already achieved species-level identification using DT (p = 0.001). The most pronounced improvement was observed among Staphylococcus spp., particularly coagulase-negative staphylococci, with complete concordance between DT and FA-assisted species-level identifications. In conclusion, on-plate FA pretreatment significantly enhances identification accuracy and diagnostic confidence for Gram-positive bacteria in routine MALDI-TOF MS workflows. Building on these findings, we propose a pragmatic, score-based, and species-aware diagnostic algorithm in which FA pretreatment is reflexively applied to Gram-positive isolates, yielding a DT log score < 2.0, with primary FA application recommended for staphylococci (particularly coagulase-negative species) and for less commonly encountered Gram-positive organisms.

Anahtar Kelimeler

• Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization (MALDI)
• Gram-Positive Bacteria
• Microbiology
• Laboratory Techniques;Clinical
• Staphylococcus

Etik Beyan

The study was approved by the noninterventional ethics committees of Istanbul Basaksehir Cam and Sakura City Hospital (Decision no: 368, Date: 23.08.2023).

Kaynakça

1. 1. Singhal, N.; Kumar, M.; Kanaujia, P.K.; Virdi, J.S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Front Microbiol 2015, 6, 791.
2. 2. Croxatto, A.; Prod'hom, G.; Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews 2012, 36, 380-407.
3. 3. University, C.S. Direct Transfer (DT) and extended Direct Transfer (eDT) Methods: Bacteria and Yeast. Available online: https://www.research.colostate.edu/pmf/wp-content/uploads/sites/17/2018/12/DT_eDT-Methods_09212013.pdf (accessed on 19 November 2025).
4. 4. Topić Popović, N.; Kazazić, S.P.; Bojanić, K.; Strunjak-Perović, I.; Čož-Rakovac, R. Sample preparation and culture condition effects on MALDI-TOF MS identification of bacteria: A review. Mass Spectrom Rev 2023, 42, 1589-1603.
5. 5. McElvania Tekippe, E.; Shuey, S.; Winkler, D.W.; Butler, M.A.; Burnham, C.A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin Microbiol 2013, 51, 1421-1427.
6. 6. Cassagne, C.; Cella, A.L.; Suchon, P.; Normand, A.C.; Ranque, S.; Piarroux, R. Evaluation of four pretreatment procedures for MALDI-TOF MS yeast identification in the routine clinical laboratory. Med Mycol 2013, 51, 371-377.
7. 7. Schulthess, B.; Bloemberg, G.V.; Zbinden, R.; Böttger, E.C.; Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for Identification of Gram-Positive Rods: Development of a Diagnostic Algorithm for the Clinical Laboratory. Journal of Clinical Microbiology 2014, 52, 1089-1097.
8. 8. Schulthess, B.; Brodner, K.; Bloemberg, G.V.; Zbinden, R.; Böttger, E.C.; Hombach, M. Identification of Gram-positive cocci by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry: comparison of different preparation methods and implementation of a practical algorithm for routine diagnostics. J Clin Microbiol 2013, 51, 1834-1840.

9. 9. Rahi, P.; Prakash, O.; Shouche, Y.S. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass-Spectrometry (MALDI-TOF MS) Based Microbial Identifications: Challenges and Scopes for Microbial Ecologists. Front Microbiol 2016, 7, 1359.
10. 10. Bizzini, A.; Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, a revolution in clinical microbial identification. Clinical Microbiology and Infection 2010, 16, 1614-1619.
11. 11. Welker, M.; Moore, E.R.B. Applications of whole-cell matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in systematic microbiology. Systematic and Applied Microbiology 2011, 34, 2-11.
12. 12. Alatoom, A.A.; Cunningham, S.A.; Ihde, S.M.; Mandrekar, J.; Patel, R. Comparison of Direct Colony Method versus Extraction Method for Identification of Gram-Positive Cocci by Use of Bruker Biotyper Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology 2011, 49, 2868-2873.
13. 13. Fenselau, C.; Demirev, P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews 2001, 20, 157-171.
14. 14. Cuénod, A.; Foucault, F.; Pflüger, V.; Egli, A. Factors Associated With MALDI-TOF Mass Spectral Quality of Species Identification in Clinical Routine Diagnostics. Front Cell Infect Microbiol 2021, 11, 646648.
15. 15. Saffert, R.T.; Cunningham, S.A.; Ihde, S.M.; Jobe, K.E.; Mandrekar, J.; Patel, R. Comparison of Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometer to BD Phoenix automated microbiology system for identification of gram-negative bacilli. J Clin Microbiol 2011, 49, 887-892.
16. 16. Calderaro, A.; Chezzi, C. MALDI-TOF MS: A Reliable Tool in the Real Life of the Clinical Microbiology Laboratory. Microorganisms 2024, 12.
17. 17. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clinical Chemistry 2015, 61, 100-111.
18. 18. Seng, P.; Drancourt, M.; Gouriet, F.; La Scola, B.; Fournier, P.-E.; Rolain, J.M.; Raoult, D. Ongoing Revolution in Bacteriology: Routine Identification of Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. Clinical Infectious Diseases 2009, 49, 543-551.