İNVAZİV FUNGAL ENFEKSİYONLARIN TANISINDA İN-HOUSE POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONUNUN DEĞERLENDİRİLMESİ / EVALUATION OF IN-HOUSE POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DIAGNOSIS OF INVASIVE FUNGAL INFECTION

Yıl 2016, Cilt: 38 Sayı: 1, 26 - 31, 22.01.2016

Müge Aslan Yasemin Öz Filiz Akşit Meltem Akay

Öz

ÖZET: Son yıllarda invaziv fungal enfeksiyonların
sıklığı bağışıklık sistemi baskılanmış hasta sayısındaki artışa paralel olarak
artmakta, önemli mortalite ve morbidite nedeni olmaktadır. Hastaların
prognozunda erken tedavinin etkisi bilinmekle birlikte, mikroskobik inceleme ve
kültür gibi yöntemlerin tanıdaki yetersizlikleri nedeniyle, genellikle mümkün
olamamaktadır. Bu nedenle invaziv fungal enfeksiyonların erken tanısına yönelik
kültür dışı yöntemleri içeren çalışmalar gündeme gelmiştir. Çalışmamızda febril
nötropenik hematolojik maligniteli hastalarda invaziv fungal enfeksiyonların
(İFE) tanısında in-house polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)’nun
değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Ocak 2011-Ocak 2012 tarihleri arasında
hematolojik malignite nedeniyle hastanemiz Hematoloji Servisi ve Kemik İliği
Transplantasyon Ünitesinde takip edilen İFE açısından riskli hastalar EORTC/MSG
kriterlerine göre proven, probable ve possible İFE olarak sınıflandırıldı.
Hastaların serum örneklerinden ticari ekstraksiyon kiti (Qiamp DNA minikit) ile
DNA izolasyonu sonrasında panfungal primerler kullanılarak amplifikasyon
uygulandı. Elde edilen PCR ürünleri agaroz jelde yürütülerek görüntülendi.
Toplam 99 hastanın 161 febril nötropenik epizodundan 358 hasta serumu elde
edildi, bunların 12’sinde (%3.35) fungal DNA saptanmış olup proven ve probable
İFE olarak tanımlanan 18 epizodun 3 (%16.66)’ ünde, düşük olasılıklı İFE
grubunda 60 epizodun 4’ünde (%6.6) 500-550 baz çiftlik bölgede bant görülmüş
olup pozitif değerlendirilmiştir. Çalışmamızda düşük duyarlılık oranları
saptanmış olup amplifikasyon şartları ve PCR reaksiyon miksinde değişiklikler
yapılarak yöntem tekrarlandığında da beklenen sonuçlar elde edilemememiştir.
Bununla birlikte, moleküler testlerde standardizasyonun sağlanması, çevre
şartlarından daha az etkilenen, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek standardize
ticari kitlerin geliştirilmesi İFE tanısına önemli katkı sağlayacağından,
benzer araştırmaların gerekli olduğu düşünülmektedir.

ANAHTAR SÖZCÜKLER: Febril nötropeni invaziv fungal
enfeksiyon, in-house PCR, tanı.

EVALUATION OF
IN-HOUSE POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DIAGNOSIS OF INVASIVE FUNGAL INFECTION

 

ABSTRACT: The incidence
of invasive fungal infection (IFI) has increased over the last years,
especially in immuncompromised patients with high mortality and morbidity
rates. Although, early diagnosis such as conventional approaches, including
direct microscopic examination and cultivation, diagnosis is difficult because
these methods low sensitivity rates of diagnosis of IFI. In recent years,
molecular diagnostic techniques have been developed, including polymerase chain
reaction (PCR). Between January 2011 and January 2012; febrile neutropenic
patients with haematologic malignancies followed in haematology and bone marrow
transplantation units were included in the present study. Patients were
classified by the European Organization for the Research and Treatment of
Cancer/Mycoses Study Group criteria as proven, probable and possible IFI. DNA
extraction from serum samples was performed using the commercial extraction kit
(Qiamp DNA minikit), after isolation of DNA amplification performed with
panfungal primers. PCR products visualized using agarose gel electrophoresis.
This study was conducted with 358 serum samples obtained from 99 patients 161
febrile neutropenic episodes. Of the samples 12 (3.35%) were found positive by
PCR. In the results, 500-550 base-paired (bp) bands obtained with universal
primers were evaluated as fungal DNA positivity. Episodes with proven and
probable IFI 16.66%, possible IFI 6.6% positive results detected. In presented
study lover sensitivity rate is determined, when the PCR amplification
conditions and reaction mix changed and method repeated but expected results
are not obtained. However the standardization of molecular tests is required;
such as less affected by environmental conditions and high sensitivity and
specificity rates, and standardized commercial kit will contribute
significantly for diagnosis IFI. We think that, similar large scale evaluations
required in future. 

KEYWORDS: Diagnosis,
febrile neutropenia, invasive fungal infection, in-house PCR.