Investigation of Babesia bovis and Babesia bigemina by Real Time PCR in Tick Species Collected from Cattle in Kayseri Province

Öz

This study was performed to investigate Babesia bigemina and B. bovis via real time PCR analyses in ge-nomic DNA pools constructed from adult ixodid ticks on cattle in different parts of Kayseri, and to detect the phyloge-netic characters of the isolates. TaqMan and Sybergreen real time PCR analyses with rap-1a and msa-2c gene specific primers for B. bigemina and B. bovis were performed in DNA pools of 1115 adult ticks. B. bovis and B. bigemina were detected in two (5.2%) and eight (21%) out of 38 DNA pools. No mix infection was determined. B. bigemina was found in four Rhipicephalus annulatus, two R. turanicus, one Hyalomma marginatum, and one H. anatolicum pools whereas both two positive B. bovis samples were detected in H. marginatum pools. Ct (cycle threshold) (dR) values were deter-mined as 35.75 and 37.71 for B. bigemina and B. bovis. Two B. bigemina positive samples were sequenced and de-posited into GenBank (KU680419-KU680420). In phylogenetic analyses of BbigrapKys1 and BbigrapKys2 isolates, 100% identity amongst themselves and 1±0.5% and 0.7±0.4% genetic distances were found with other similar isolates from the world and Turkey. In conclusion, the scientific knowledge was obtained about the molecular prevalence of B. bigemina and B. bovis in ticks collected from cattle in Kayseri province and also about molecular characterization and phylogenies of some positive isolates.

Anahtar Kelimeler

• Babesia bovis,Babesia bigemina,Kayseri,molecular characterization,real time PCR,tick

Kayseri Yöresindeki Sığırlardan Toplanmış Kene Türlerinde Babesia bovis ve Babesia bigemina’nın Real Time PCR Yöntemiyle Araştırılması*

Öz

Bu çalışma, Kayseri’nin farklı lokalizasyonlarındaki sığırlardan toplanmış erişkin ixodid kenelerden oluşturulmuş genomik DNA havuzlarında Babesia bigemina ve B. bovis’in real time PCR analizleriyle araştırılması ve izolatların filo-genetik karakterlerinin saptanması amacıyla gerçekleştirilmiştir. Sığırlardan toplanmış 1115 erişkin ixodid keneden oluşturulmuş DNA havuzlarında, B. bigemina ve B. bovis için rap-1a ve msa-2c gen bölgelerini amplifiye eden primer-lerle TaqMan prob bazlı ve Sybergreen tabanlı real time PCR analizleri yapılmıştır. Toplam 38 genomik DNA havuzu-nun ikisinde (%5.2) B. bovis ve sekizinde (%21) B. bigemina pozitifliği saptanmıştır. Miks enfeksiyon belirlenmemiştir. Babesia bigemina pozitiflerin dördü Rhipicephalus annulatus, ikisi R. turanicus, biri Hyalomma marginatum ve biri H. anatolicum havuzlarında, B. bovis pozitiflerin ikisi de H. marginatum havuzunda saptanmıştır. Ct (cycle threshold) (dR) değerleri B. bigemina ve B. bovis için ortalama 35.75 ve 37.71 belirlenmiştir. Moleküler karakterizasyon amacıyla nes-ted PCR analizleriyle uygun DNA bant profilleri gösteren B. bigemina pozitif sekiz örnekten ikisi sekanslanmış ve Gen-Bank kayıtları (KU680419-KU680420) gerçekleştirilmiştir. BbigrapKys1 ve BbigrapKys2 izolatlarının filogenetik analizle-rinde kendi aralarında %100 identiklik, Dünyadaki ve Türkiye’deki diğer benzer izolatlarla %1±0.5 ve %0.7±0.4 genetik farklılık tespit edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışmayla, Kayseri yöresindeki sığırlardan temin edilmiş kenelerde B. bigemi-na ve B. bovis’in varlığı ve moleküler prevalansı ile pozitif bazı izolatların moleküler karakterizasyonu ve filogenileri hakkında bilimsel veriler elde edilmiştir.

Anahtar Kelimeler

• Babesia bovis,Babesia bigemina,Kayseri,kene,moleküler karakterizasyon,real time PCR

Kaynakça

1. 1. Adham FK, Abd-el-Samie EM, Gabre RM, el- Hussein H. Detection of tick blood parasites in Egypt using PCR assay I-Babesia bovis and Babesia bigemina. Parasitol Res 2009; 105(3): 721-30.
2. 2. Aktas M, Altay K, Ozubek S, Dumanlı N. A survey of ixodid ticks feeding on cattle and prevalence of tick-borne pathogens in the Black Sea region of Turkey. Vet Parasitol 2012; 187(3-4): 567-71.
3. 3. Aydin L, Bakirci S. Geographical distribution of ticks in Turkey. Parasitol Res 2007; Suppl 2:163-6.
4. 4. Bock R, Jackson L, de Vos A, Jorgensen W. Babesiosis of cattle. Parasitology 2004; 129(1): 247-69.
5. 5. Borgonio V, Mosqueda J, Genis AD, Falcon A, Alvarez JA, Camacho M, Figueroa JV. msa-1 and msa-2c gene analysis and com-mon epitopes assessment in Mexican Babe-sia bovis isolates. Ann N Y Acad Sci 2008; 1149:145-8.
6. 6. Bursali A, Keskin A, Tekin S. A review of the ticks (Acari: Ixodida) of Turkey: Species di-versity, hosts and geographical distribution. Exp Appl Acarol 2012; 57(1): 91-104.
7. 7. Cao S, Aboge GO, Terkawi MA, Yu L, Kam-yingkird K, Luo Y, Li Y, Goo YK, Yamagishi J, Nishikawa Y, Yokoyama N, Suzuki H, Iga-rashi I, Maeda R, Inpankaew T, Jittapala-pong S, Xuan X. Molecular detection and identification of Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle in Northern Thailand. Pa-rasitol Res 2012; 111(3):1259-66.
8. 8. Criado-Fornelio A, Buling A, Asenzo G, Beni-tez D, Florin-Christensen M, Gonzalez-Oliva A, Henriques G, Silva M, Alongi A, Agnone A, Torina A, Madruga CR.. Development of fluorogenic probe-based PCR assays for the detection and quantification of bovine pirop-lasmids. Vet Parasitol 2009; 162(3-4): 200-6.

9. 9. Criado-Fornelio A. A review of nucleic-acid-based diagnostic tests for Babesia and Thei-leria, with emphasis on bovine piroplasms. Parassitologia 2007(1); 49: 39-44.
10. 10.Çiçek H. Ankara yöresinde Haemaphysalis türleri üzerinde epizootiyolojik araştırmalar. Turk J Vet Anim Sci 2004; 28: 107-13.
11. 11.Dantas-Torres F, Chomel B, Otranto D. Ticks and tick-borne diseases: A OneHealth pers-pective. Trends Parasitol 2012; 28(10): 437-46.
12. 12.Drummond AJ, Ashton B, Buxton S. Genei-ous v5.5 http://www.geneious.com, Erişim tarihi: 05.05.2014.
13. 13.Düzlü Ö, İnci A, Yıldırım A. Karadeniz Bölge-si'ndeki sığırlardan elde edilen Babesia bovis suşlarının moleküler karakterizasyonu. Erci-yes Üniv Sağ Bil Derg 2011; 20(1): 18-28.
14. 14.Düzlü Ö, İnci A, Yıldırım A. Türkiye’de evcil ruminantlarda babesiosis. Türkiye Klinikleri J Vet Sci 2012; 3(2): 27-34.
15. 15.Düzlü Ö, Yıldırım A, İnci A, Avcıoğlu H, Bal-kaya İ. Sığırlarda Babesia bovis ve Babesia bigemina'nın real-time PCR ile araştırılması ve izolatların moleküler karakterizasyonu, Ankara Üniv Vet Fak Derg 2015; 62: 27-35.
16. 16.Güler S. Ankara ve civarındaki koyun ve ke-çilerde kış Ixodidae’leri üzerine araştırmalar. Uludağ Üniv Vet Fak Derg 1982; 1: 45-54.
17. 17.Hoffmann G, Hörchner F, Schein E, Gerber H. Saisonales auftreten von zecken und pi-roplasmen bei haustieren in des asiatischen provinzen der Turkei. Berl Münch Tierarztl Wschr 1971; 84: 152-6.
18. 18.Ica A, Vatansever Z, Yildirim A, Duzlu O, Inci A. Detection of Theileria and Babesia spe-cies in ticks collected from cattle. Vet Parasi-tol 2007; 148(2): 156-60.
19. 19.Ionita M, Mitrea I, Pfister K, Hamel D, Silaghi C. Molecular evidence forbacterial and proto-zoan pathogens in hard ticks from Romania. Vet Parasitol 2013;196(1-2): 71-6.
20. 20.Kim C, Iseki H, Herbas MS, Yokoyama N, Suzuki H, Xuan X, Fujisaki K, Igarashi I. Development of TaqMan-based real-time PCR assays for diagnostic detection of Ba-besia bovis and Babesia bigemina. Am J Trop Med Hyg 2007; 77(5): 837-41.
21. 21.Kumsa B, Signorini M, Teshale S, Tessarin C, Duguma R, Ayana D, Martini M, Cassini R. Molecular detection of piroplasms in ixodid ticks infesting cattle and sheep in wes-tern Oromia, Ethiopia. Trop Anim Health Prod 2014; 46(1): 27-31.
22. 22.Kurtpınar H. Türkiye Keneleri, Morfoloji, Bi-yoloji, Konakçı Yayılışları ve Medikal Önem-leri. Ankara: Güven Matbaası, 1954; s. 96-112.
23. 23.Merdivenci A. Türkiye keneleri üzerine araş-tırmalar. İstanbul Cerrahpaşa Tıp Fak Yay. 1969; 1448-53.
24. 24.Mimioğlu M. Die schieldzecken (Ixoden) der haustiere in der Turkei. Ankara Univ Vet Fak Derg 1954; 1: 20-35.
25. 25.Ogo NI, de Mera IG, Galindo RC, Okubanjo OO, Inuwa HM, Agbede RI, Torina A, Alongi A, Vicente J, Gortázar C, de la Fuente J. Molecular identification of tick-borne patho-gens in Nigerian ticks. Vet Parasitol 2012; 187(3-4): 572-7.
26. 26.Oliveira-Sequeira TC, Oliveira MC, Araujo JP, Amarante AF. PCR-based detection of Babesia bovis and Babesia bigemina in their natural host Boophilus microplus and cattle. Int J Parasitol 2005; 35(1): 105-11.
27. 27.Petrigh R, Ruybal P, Thompson C, Neumann R, Moretta R, Wilkowsky S, Draghi G, Echai-de I, de Echaide ST, Farber M. Improved molecular tools for detection of Babesia bi-gemina. Animal biodiversity and emerging diseases. Ann N YAcad Sci 2008; 1149:155-7.
28. 28.Ramos CA, Araújo FR, Souza II, Bacanelli G, Luiz HL, Russi LS, Oliveira RH, Soares CO, Rosinha GM, Alves LC. Real-time poly-merase chain reaction based on msa2c gene for detection of Babesia bovis. Vet Parasitol 2011; 176(1): 79-83.
29. 29.Sam-Yellowe TY. Rhoptry organelles of the apicomplexa: Their role in host cell invasion and intracellular survival. Parasitol Today 1996; 12(8): 308-16.
30. 30.Sayın F, Dinçer Ş, Karaer Z, Çakmak A, Yu-karı BA, Eren H, Değer S, Nalbantoğlu S. Status of tick infestation in sheep and goats in Turkey. Parassitologia 1997; 39(2): 145-52.
31. 31.Shebish E, Vemulapalli R, Oseto C. Preva-lence and molecular detection of Anaplasma marginale, Babesia bovis and Babesia bi-gemina in cattle from Puntarenas Province, Costa Rica. Vet Parasitol 2012; 188(1-2): 164-7.
32. 32.Suarez CE, Palmer GH, Hötzel I, McElwain TF. Structure, sequence, and transcriptional analysis of the Babesia bovis rap-1 multige-ne locus. Mol Biochem Parasitol 1998; 93(2): 215-22.
33. 33.Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: Molecular evo-lutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maxi-mum parsimony methods. Mol Biol Evol 2011; 28(10): 2731-9.
34. 34.Terkawi MA, Huyen NX, Shinuo C, Inpan-kaew T, Maklon K, Aboulaila M, Ueno A, Goo YK, Yokoyama N, Jittapalapong S, Xuan X, Igarashi I. Molecular and serologi-cal prevalence of Babesia bovis and Babesia bigemina in water buffaloes in the northeast region of Thailand. Vet Parasitol 2011; 178(3-4): 201-7.
35. 35.Tsai YL, Chomel BB, Chang CC, Kass PH, Conrad PA, Chuang ST. Bartonella and Ba-besia infections in cattle and their ticks in Taiwan. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2011; 34(2): 179-87.
36. 36.Uilenberg G. Babesia – A historical over-view. Vet Parasitol 2006; 138(1-2): 3-10.
37. 37.Wilkowsky SE, Farber M, Echaide I, Torioni de Echaide S, Zamorano PI, Dominguez M, Suarez CE, Florin-Christensen M. Babesia bovis merozoite surface protein-2c (MSA-2c) contains highly immunogenic, conserved B-cell epitopes that elicit neutralization-sensitive antibodies in cattle. Mol Biochem Parasitol 2003; 127(2): 133-41.
38. 38.Wilkowsky SE, Farber M, Gil G, Echaide I, Mosqueda J, Alcaraz E. Molecular characte-rization of Babesia bovis strains using PCR restriction fragment length polymorphism analysis of the msa2-a/b genes. Ann N Y Acad Sci 2008; 1149: 141-4.
39. 39.Yavuz A, İnci A, Düzlü Ö, Bişkin Z, Yıldırım A. Molecular characterization of Babesia bo-vis msa-2c gene. Turkiye Parazitol Derg 2011; 35(3): 140-4.