AKIM SİTOMETRİ’DE RNA ÖLÇÜMÜNÜN ÖZGÜNLÜĞÜ VE GÜVENİRLİLİĞİ

Öz

Bu çalışmanın amacı akım sitomeride (AS) ile ölçümünün özgün ve güvenilir olup olmadığını test etmektir. Bu amaçla; RNA içeriği bilinen farklı hücreler ve RNA sentezini durduran ajanlar kullanılarak AS deki RNA ölçümünün özgünlüğü ve güvenirliliği dört ayrı işlemle test edildi.1) Periferal Kan Medyum içerisinde, mitojenle uyarılmış mononükleer hücrelerin (PKMNH=periferal kan mononukleer hücre) RNA içerikleri AS ile ve kit ile izole edilip spektrofotometride ölçülerek karşılaştırıldı. Her iki yöntemle bulunan sonuçların birbiriyle uyumlu oldukları görüldü (p=0.026, r=0.974) 2) AS’de RNA ölçümünün yinelenebilirliği aynı ve farklı kişilerden alınan örnekler çalışılarak test edildi. a) Sağlıklı bir kişiden 8 ml kan alınarak 4 farklı tüpe bölündü. Bölünen kanların mononükleer hücreleri izole edildi, boyandı ve RNA içerikleri AS’de ölçüldü. Aynı kişiye ait kan örneklerinin RNA içerikleri arasındaki varyasyon katsayısı (V)=%0,75 olarak bulundu. b) Beş sağlıklı kişiden 2 şer ml kan alındı ve mononükleer hücreleri izole edildi, boyandı ve RNA içerikleri AS’de ölçüldü. Beş sağlıklı kişinin RNA içerikleri arasındaki varyasyon katsayısı (V)= %1.72 olarak bulundu. 3) Aktinomisin deneyi: Aynı kişinin mononükleer hücreleri Periferal Kan Medyum içeren iki kültür flaskına ekilerek iki gün mitojenle uyarıldı. Kültür flasklarından birine RNA sentezini durudurmak amacıyla 24. saatte 0.05 µg/ml aktinomisin D ilave edildi, diğerine ise herhangi bir işlem yapılmadı. Mitojenle uyarılan mononükleer hücrelerin 48 saat sonra RNA içerikleri AS ile ölçüldü. Sonuçta aktinomisin-D ile etkileştirilmiş olan hücrelerin RNA içeriğinin artmadığı AS ile belirlendi. 4) RNA içerikleri bilinen hücrelerin F640 meanX değerlerinin AS ölçümlerinin karşılaştırılması: ALL (Akut Lenfoblastik Lösemi), AML (Akut Miyeloid Lösemi)’li hastalardan ve sağlıklı bir kişiden 2’şer ml kan örneği alınarak, mononükleer hücreleri izole edildi, boyandı ve RNA içerikleri AS’de ölçüldü. ALL ve AML’li hastaların hücrelerinin RNA içerikleri sağlıklı bireyin hücrelerinin RNA içeriğinden daha yüksek bulundu. Sonuç olarak Türkiye’de hiç çalışılmamış, optimize edilmemiş olan AS’de RNA ölçüm yöntemi, yapılan bu çalışma ile hem tanı amaçlı, hem de araştırma amaçlı kullanılabilir, özgün ve güvenilir bir yöntem olarak geliştirilmiştir

Anahtar Kelimeler

• Akım sitometri, RNA ölçümü, RNaz-A

The Specificity and Reliability of RNA Measurement in Flow Cytometry

Öz

The aim of this work is to establish whether or not specificity/ reliability of our RNA measurement in flow cytometry is consistent. RNA measurement specificity was established using various cells with known RNA content and blocking agents: 1) Results of the comparison of the RNA content during the mitogen-stimulated growth of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMNCs) in Peripheral Blood Medium found by our flow cytometric method and by the kit were compared. The results obtained with the two different methods were concordant (p=0.026, r=0.974). 2) Replicability of the RNA (F640 mean X) measurement for the same and for different individuals: a) 8 ml of peripheral blood sample from a healthy individual was divided into 4 portions and each of which was submitted for isolation, staining and fluorescence measurement procedures. Variation coefficient (V) was found as 0.75% among RNA contents of the tubes (V=0.75) .b) 2 ml of peripheral blood samples from 5 healthy individuals was submitted for isolation, staining and fluorescence measurement procedures. Variation cofficient (V) was found as 1.72% among RNA contents of the five healthy individulals (V=1.72 %). Actinomycin D experiment: The two PBMNCs flasks from a healthy individual were cultured in Peripheral Blood Karyotyping Medium simultaneously for 2 days. One of the flasks received 0, 05 µg/ml of actinomycin D 24 h after the initiation of the cultures and cell luminescence of each flask was measured at 48 h. We did not obtain an increase in cellular RNA content in actinomycin D treated cells versus untreated cells, 4) Comparison of F640 mean X measurements in the cells of known character in RNA content: 2 ml of peripheral blood samples from ALL, AML patients and healthy control was submitted to isolation, staining and fluorescence measurement procedures. RNA content of ALL and AML patients’ cells were higher than those of healthy control. This experiment shows that our F640 mean X measurement indicates the RNA level in the cell. We concluded that our evaluation of the relative RNA content is reliable

Anahtar Kelimeler

• Flow cytometry, RNA measurement,RNase-A

Kaynakça

1. Darzynkiewicz Z. Simultaneous analysis of cellular RNA and DNA content, Methods in Cell Biology, Academic Press 1994, Vol. 41: pp 401-420,
2. Hiraki M. Intracellular DNA and RNA in the course of tumor growth. Kurume Med J 1994, 41: 1-13.
3. Grunwald D. Flow Cytometry and RNA studies. Biol Cell 1993, 78: 27-30.
4. Darzynkiewicz Z,Tragonos F,Sharpless T, Melamed MR. Lymphocyte stimulation: A rapid multiparameter analysis. Medical Sciences1976,73: 2881- 2884.
5. Traganos F, Darzynkiewicz Z, Sharpless T, Melamed MR. Simultaneous staining of ribonucleic and deoxyribonucleic acids in unfixed cells using acridine orange in a flow cytofluorometric system. J Histochem Cytochem 1977, 25: 46-56.
6. Yılmaz MT, Deniz G. Cytometry’nin çalışma mekanizması ve prensipleri. Bilmedya grup, Aktüel Tıp Dergisi, İstanbul1999, ss 1-9.
7. Radcliff G, Jaroszeski MJ. Basic of Flow Cytometry. In: Jarazeski, MJ, Heller, R. (Eds). Methods in Molecular Biology. Flow cytometry Protocols, Humana Press Inc., Totawa, NJ, 1988, 91:1-24.
8. Steck K, El-Naggar A. Simultaneous DNA/RNA analysis of solid and hematoreticular malignancies. In: Jarazeski MJ, Heler R. (Eds), Methods in Molecular Biology. Flow cytometry Protocols. Humana Press Inc, Totawa, NJ, 1988, 91: 167-180.

9. Toba K, Winton E F, Koike T, Shibata A. Simultaneous three color analysis of surface phenotype and DNA-RNA quantitation using 7- amino-actinomycin D and pyronin Y. J Immunol Meth 1995, 182:193-207.
10. Darzynkiewicz Z. DNA-RNA differential staining using AO. In: Robinson JP (Ed), Handbook of Flow Cytometry Methods. A John Wıley and Sons Inc, USA 1993, p114.
11. Hiddeman W, Wörmann B, Messerer D, Sprngefeld R, Büchner Th. Analysis of the cellular DNA and RNA content in acute leukemias by Flow Cytometry. J Cancer Res Clin Oncol 1990, 116: 507-512.