Fare Metastaz Modelinde Luciferaz Ekspresyonu Gösteren LLC-1 Akciğer Kanseri Hücrelerinin Mikrometastazlarının Tespiti: qPCR ve Biyolüminesans Görüntülemenin Karşılaştırılması

Öz

Bu çalışma, luciferaz eksprese eden Lewis Akciğer Karsinomu hücreleri (LLC1-Luc2) kullanılarak oluşturulmuş bir fare akciğer kanseri modelinde mikrometastazların tespitini araştırmaktadır. Çalışmada biyolüminesans görüntüleme ile erkeklere özgü cinsiyet belirleyici bölge Y genini hedefleyen kantitatif PCR yöntemleri karşılaştırılmıştır. LLC1-Luc2 hücreleri, eşgenik metastaz modeli oluşturmak amacıyla dişi C57BL/6 farelerine intravenöz olarak enjekte edilmiştir. Metastatik ilerleme, 1., 7., 14., 21. ve 28. günlerde kaydedilen luciferaz sinyalleri ile dört hafta boyunca akciğer ve karaciğerlerde biyolüminesans görüntüleme kullanılarak takip edilmiştir. Aynı zamanda, erkek kökenli LLC1-Luc2 hücreleri ile dişi konaklar arasındaki cinsiyet uyumsuzluğundan yararlanılarak erkeklere özgü cinsiyet belirleyici bölge Y geninin amplifikasyonu yoluyla kantitatif PCR ile metastatik hücre sayıları belirlenmiştir. Hücre sayıları ile kantitatif PCR döngü eşik değerleri arasındaki korelasyonu göstermek amacıyla bir standart eğri oluşturulmuş ve böylece metastatik yükün hassas tahmini sağlanmıştır. Sonuçlar, biyolüminesans görüntülemenin derin dokulardaki metastatik odakları etkili biçimde görselleştirdiğini, ancak kantitatif PCR’ın özellikle erken evrelerde veya düşük hücre sayısına sahip lezyonlarda mikrometastazların tespitinde üstün duyarlılık sağladığını göstermiştir. Biyolüminesans görüntüleme ile cinsiyet belirleyici bölge Y genine dayalı kantitatif PCR’ın entegrasyonu, metastazın nitel ve nicel değerlendirilmesi için sağlam bir çerçeve sunmakta ve antimetastatik tedavilerin preklinik değerlendirilmesi için değerli bilgiler sağlamaktadır.

Anahtar Kelimeler

• akciğer kanseri
• metastaz
• karaciğer
• Y kromozomu
• in vivo görüntüleme

Detection of Micrometastases of Luciferase-Expressing LLC-1 Lung Cancer Cells in a Mouse Metastasis Model: Comparison of qPCR and Bioluminescence Imaging

Öz

This study investigates the detection of micrometastases in a mouse model of lung cancer using luciferase-expressing Lewis Lung Carcinoma cells (LLC1-Luc2), comparing bioluminescence imaging and quantitative PCR targeting the sex determining region Y gene. LLC1-Luc2 cells were intravenously injected into female C57BL/6 mice to establish a syngeneic metastasis model. Metastatic progression in lungs and liver was monitored over four weeks using bioluminescence imaging, with luciferase signals recorded on days 1, 7, 14, 21, and 28. Concurrently, quantitative PCR was employed to quantify metastatic cell numbers by amplifying the male-specific sex determining region Y gene, leveraging the sex mismatch between male-derived LLC1-Luc2 cells and female hosts. A standard curve was generated to correlate quantitative PCR cycle threshold values with cell numbers, enabling precise estimation of metastatic burden. Results demonstrated that BLI effectively visualized metastatic foci in deep tissues, while quantitative PCR provided superior sensitivity for detecting micrometastases, particularly at early stages or in low-cell-number lesions. The integration of bioluminescence imaging and sex determining region Y gene quantitative PCR offers a robust framework for both qualitative and quantitative assessment of metastasis, providing valuable insights for preclinical evaluation of anti-metastatic therapies

Anahtar Kelimeler

• lung cancer
• metastasis
• liver
• Y chromosome
• in vivo imaging

Etik Beyan

The experimental procedures in this study were all carried out in accordance with the institutional guidelines and approved by the Hacettepe University Animal Experiments Ethical Committee (2024/19).

Teşekkür

I would like to thank Associate Prof. Yağmur Akdağ Çaylı for LLC-1-Luc2 cells

Kaynakça

1. Bertram, J. S., & Janik, P. (1980). Establishment of a cloned line of Lewis lung carcinoma cells adapted to cell culture. Cancer Letters, 11(1), 63–73.Carlson BM. Human embryology and developmental biology. 4th ed. St. Louis: Mosby; 2009.
2. ATCC. (2023). LL/2-Luc2 - CRL-1642-LUC2. https://www.atcc.org/products/crl-1642-luc2
3. Deng, W., McLaughlin, S. L., & Klinke, D. J. (2017). Quantifying spontaneous metastasis in a syngeneic mouse melanoma model using real-time PCR. Analyst, 142(16), 2945–2953.
4. Kuo, T. H., Kubota, T., Watanabe, M., Furukawa, T., Kase, S., Tanino, H., ... & Hoffman, R. M. (2015). Preclinical murine models for lung cancer: Clinical opportunities and challenges. BioMed Research International, 2015, 621324.
5. Xu, Z., Zhang, Y., Zhang, Y., Wang, Y., & Zhang, Y. (2022). In vivo growth of subclones derived from Lewis lung carcinoma is determined by the tumor microenvironment. Frontiers in Oncology, 12, 9729899.
6. Miyakawa, Y., Oda, Y., & Furukawa, T. (2018). Transgenic mice accepting luciferase-expressing tumor cells enable real-time tracking of tumor growth and metastasis. Genes to Cells, 23(10), 913–922.
7. Contag, C. H., & Bachmann, M. H. (2002). Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression and protein–protein interactions. Annual Review of Biomedical Engineering, 4, 235–260.
8. Chi, J. Y., Hsiao, Y. W., Liu, H. L., Fan, X. J., Wan, X. B., Liu, T. L., Hung, Y. H., Shen, M. R., & Wang, J. M. (2021). Fibroblast CEBPD/SDF4 axis in response to chemotherapy-induced angiogenesis through CXCR4. Cell Death Discovery, 7, 94

9. Schneider, T., Osl, F., Friess, T., Stockinger, H., & Scheuer, W. (2002). Quantification of human Alu sequences by real-time PCR—An improved method to measure therapeutic efficacy of anti-metastatic drugs in human xenotransplants. Clinical & Experimental Metastasis, 19(7), 571–582.
10. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., & Sterling, J. A. (2015). TRIzol- and Alu-qPCR–based quantification of metastatic seeding within the skeleton. Scientific Reports, 5, 12635.
11. Funakoshi, T., Tachibana, I., Hoshino, H., Iizasa, H., Yoshida, M., & Takahashi, H. (2017). A novel quantitative PCR-based method for detecting spontaneous lung metastasis in murine cancer models. Oncology Reports, 38(1), 289–296.
12. Troy, T. L., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., & Rice, B. W. (2004). Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging, 3(1), 9–23.
13. Zhao, H., Doyle, T. C., Coquoz, O., Kalish, F., Rice, B. W., & Contag, C. H. (2005). Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics, 10(4), 041210.
14. Badr, C. E., & Tannous, B. A. (2011). Bioluminescence imaging: Progress and applications. Cell Cycle, 10(24), 3901–3910.
15. Keyaerts, M., Caveliers, V., & Lahoutte, T. (2012). Bioluminescent imaging: Highlighting its advantages and limitations in preclinical imaging. Methods, 66(2), 213–218
16. Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J., et al. (2008). Inhibition of tumor progression in vivo by noninvasively imaging growth dynamics with luciferase reporters. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 35(6), 1172–1181.
17. Zabala, M., Mearini, E., Prinsloo, E., et al. (2009). Assessment of tumor progression in a mouse breast cancer model using bioluminescence imaging. Molecular Imaging and Biology, 11(6), 415–423.
18. Haider, M. T., Freytag, V., Krause, L., et al. (2024). Comparison of ex vivo bioluminescence imaging, Alu-qPCR and histology for the quantification of spontaneous lung and bone metastases in subcutaneous xenograft mouse models. Clinical & Experimental Metastasis, 41, 103–115.
19. Ribot, E. J., Lee, S. C., Tritt, S., et al. (2015). Comparison of bioluminescence imaging and qPCR quantification of metastatic tumor burden in small animal models. Journal of Biomedical Optics, 20(3), 036003.
20. Looney, T. J., Lee, J., & Lee, C. (2012). Comparative evaluation of imaging and molecular quantification methods for tumor burden assessment. Molecular Imaging and Biology, 14(5), 584–592.
21. Condeelis, J., & Weissleder, R. (2010). In vivo imaging in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2(12), a003848.