Taze ve kurutulmuş Pinus brutia iğne yapraklarından DNA ekstraksiyonunun farklı homojenizasyon yöntemleriyle optimizasyonu: Adli botanik uygulamaları için bir yaklaşım

Öz

Bitki dokularından yeterli miktarda DNA elde edilmesi; moleküler taksonomi, popülasyon genetiği, koruma biyolojisi ve adli botanik uygulamaları açısından önem taşımaktadır. Ancak iğne yapraklı türlerden DNA izolasyonu, dokuların yüksek miktarda polisakkarit, polifenol, terpenoid ve reçine bileşikleri içermesi nedeniyle güçleşmekte; bu bileşikler DNA izolasyonunu ve sonraki moleküler analizleri olumsuz etkileyebilmektedir. Bu çalışmada, Türkiye’de yaygın olarak bulunan Pinus brutia iğne yapraklarında örnek durumu ve homojenizasyon yönteminin elde edilen DNA konsantrasyonu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda Çanakkale ilinde bulunan 24 farklı P. brutia ağacından iğne yaprak örnekleri toplanmıştır. On iki ağaçtan alınan örnekler taze olarak işlenirken, diğer 12 ağaçtan alınan örnekler laboratuvar koşullarında 20 gün süreyle kurutulmuştur. Her bir örnek durumu içerisinde örnekler, havanda öğütme sonrasında TissueLyser ile homojenizasyon ve blender ile homojenizasyon olmak üzere iki farklı yöntemle işlenmiştir. Genomik DNA, i-genomic Plant DNA Extraction Mini Kit kullanılarak izole edilmiş ve DNA konsantrasyonu Qubit™ 4 Florometre ile dsDNA High Sensitivity Assay kiti kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen veriler iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirilmiştir. Taze örneklerde kurutulmuş örneklere göre daha yüksek DNA konsantrasyonları elde edilirken, havanda öğütme sonrasında TissueLyser ile homojenizasyon uygulanan örneklerde blender ile homojenize edilen örneklere göre daha yüksek DNA konsantrasyonları belirlenmiştir. İki yönlü ANOVA, örnek durumu ve homojenizasyon yönteminin DNA konsantrasyonu üzerinde anlamlı ana etkilerinin yanı sıra iki faktör arasında anlamlı bir etkileşim bulunduğunu göstermiştir. Bu bulgular hem örnek durumunun hem de homojenizasyon yönteminin P. brutia iğne yapraklarından elde edilen DNA konsantrasyonunu etkilediğini göstermekte ve moleküler bitki araştırmaları ile adli botanik uygulamalarında DNA ekstraksiyon prosedürlerinin örnek özelliklerine göre optimize edilmesinin önemini ortaya koymaktadır.

Anahtar Kelimeler

• Bitki moleküler biyolojisi
• adli botanik
• DNA ekstraksiyonu
• homojenizasyon
• Pinus brutia

Destekleyen Kurum

Üsküdar Üniversitesi Bağımlılık ve Adli Bilimler Enstitüsü

Etik Beyan

Bu çalışma yalnızca bitki materyali üzerinden gerçekleştirilmiş olup insan katılımcılar, deney hayvanları veya kişisel veri kullanımını içermediğinden etik kurul onayı gerektirmemektedir.

Teşekkür

Yazarlar, bu çalışmanın gerçekleştirilmesinde laboratuvar altyapısı ve teknik olanakları sağlayan Üsküdar Üniversitesi Bağımlılık ve Adli Bilimler Enstitüsü'ne teşekkür eder.

Optimization of DNA extraction from fresh and dried Pinus brutia needles using different homogenization methods: An approach for forensic botanical applications

Öz

Obtaining sufficient DNA from plant tissues is essential for molecular taxonomy, population genetics, conservation biology, and forensic botany. However, DNA extraction from conifer species remains challenging because their tissues contain high concentrations of polysaccharides, polyphenols, terpenoids, and resin compounds that may interfere with DNA isolation and downstream molecular analyses. This study aimed to evaluate the effects of sample condition and homogenization method on DNA concentration obtained from fresh and dried needles of Pinus brutia, one of the most widespread conifer species in Türkiye. Needle samples were collected from 24 individual trees in Çanakkale, Türkiye. Samples from 12 trees were processed fresh, whereas samples from the remaining 12 trees were air-dried for 20 days. Within each sample condition, samples were processed using two homogenization methods: mortar grinding followed by TissueLyser homogenization and blender homogenization. Genomic DNA was extracted using the i-genomic Plant DNA Extraction Mini Kit and quantified using a Qubit™ 4 Fluorometer with the dsDNA High Sensitivity Assay. Data were analyzed using two-way analysis of variance (ANOVA). Fresh samples showed higher DNA concentrations than dried samples, and mortar grinding followed by TissueLyser homogenization resulted in higher DNA concentrations than blender homogenization. Two-way ANOVA demonstrated significant main effects of sample condition and homogenization method on DNA concentration, as well as a significant interaction between the two factors. These findings indicate that both sample condition and homogenization method influence DNA concentration obtained from P. brutia needles and highlight the importance of sample-specific optimization of DNA extraction procedures for molecular plant research and forensic botanical applications.

Anahtar Kelimeler

• Molecular plant biology
• forensic botany
• DNA extraction
• homogenization
• Pinus brutia

Destekleyen Kurum

Üsküdar University Institute of Addiction and Forensic Sciences

Etik Beyan

Ethical approval was not required for this study because no human participants, animals, or personal data were involved.

Teşekkür

The authors would like to thank the Institute of Addiction and Forensic Sciences, Üsküdar University, for providing the laboratory facilities and technical infrastructure that supported this study.

Kaynakça

1. Alotaibi SS, Sayed SM, Alosaimi M, Alharthi R, Banjar A, Abdulqader N, Alhamed R (2020). Pollen molecular biology: Applications in the forensic palynology and future prospects: A review. Saudi Journal of Biological Sciences 27: 1185-1190.
2. Ateş Sönmezoğlu Ö, Terzi B (2019). Comparison of DNA extraction protocols for PCR-based techniques in wheat. Avrupa Bilim ve Teknoloji Dergisi 17: 860-865.
3. Boydak M (2004). Silvicultural characteristics and natural regeneration of Pinus brutia Ten.-A review. Plant Ecology 171: 153-163.
4. Corradini B, Gianfreda D, Ferri G, Ferrari F, Borciani I, Santunione AL, Cecchi R (2024). Forensic species identification: Practical guide for animal and plant DNA analysis. International Journal of Legal Medicine 138: 2271-2280.
5. Coyle HM (2004). Forensic botany: Principles and applications to criminal casework. Boca Raton: CRC Press. Domínguez-Rodríguez G, Marina ML, Plaza M (2020). Latest developments in polyphenol recovery and purification from plant by-products: A review. Trends in Food Science & Technology 99: 375-388.
6. Houck MM, Siegel JA (2022). Fundamentals of forensic science. London: Academic Press.
7. iNtRON Biotechnology Inc. (2021). i-genomic Plant DNA Extraction Mini Kit user manual. Seongnam: iNtRON Biotechnology Inc.
8. Kavgacı A, Çoban S, Chytrý M, Bonari G, et al. (2021). Classification of forest and shrubland vegetation in Mediterranean Turkey. Applied Vegetation Science 24: e12589.

9. Kistler L, Bieker VC, Martin MD, Pedersen MW, Ramos-Madrigal J, Wales N (2020). Ancient plant genomics in archaeology, herbaria, and the environment. Annual Review of Plant Biology 71: 605-629.
10. Latorre SM, Lang PLM, Burbano HA, Gutaker RM (2020). Isolation, library preparation, and bioinformatic analysis of historical and ancient plant DNA. Current Protocols in Plant Biology 5(4): e20121.
11. Lee CL, Huang YH, Hsu IC, Lee HC (2019). Evaluation of plant seed DNA and botanical evidence for potential forensic applications. Forensic Sciences Research 5(1): 55-63.
12. Maughan PJ, Yourstone SM, Byers RL, Smith SM, Udall JA (2023). Optimizing the lysis step in CTAB DNA extractions of silica-dried and herbarium leaf tissues. Applications in Plant Sciences 11: e11517.
13. Mitchell N, McAssey EV, Hodel RGJ (2023). Emerging methods in botanical DNA/RNA extraction. Applications in Plant Sciences 11(3) : e11530.
14. Mofikoya OO, Eronen E, Mäkinen M, Jänis J (2023). Production and characterization of hydrothermal extracts of the needles from four conifer tree species: Scots pine, Norway spruce, common juniper, and European larch. ACS Sustainable Chemistry & Engineering 11: 1540-1547.
15. Oliveira M, Azevedo L, Ballard D, Branicki W, Amorim A (2023). Using plants in forensics: State-of-the-art and prospects. Plant Science 336: 111860.
16. Paranaíba RTF, Carvalho CBV, Paiva RS, Trindade BR, Barros MG, Souza EP, Gontijo AB, Silveira D (2020). DNA from wood – A simple approach facing a challenging matrix – A preliminary study. Forensic Science International 314: 110371.
17. QIAGEN (2021). TissueLyser LT handbook. Hilden: QIAGEN.
18. Särkinen T, Staats M, Richardson JE, Cowan RS, Bakker FT (2012). How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE 7: e43808.
19. Sugita N, Ebihara A, Hosoya T, Jinbo U, Kaneko S, Kurosawa T, Nakae M, Yukawa T. (2020). Non-destructive DNA extraction from herbarium specimens: A method particularly suitable for plants with small and fragile leaves. Journal of Plant Research 133(1): 133-141.
20. Thermo Fisher Scientific (2020). Qubit™ dsDNA HS Assay Kit user guide. Waltham: Thermo Fisher Scientific.
21. Terzi Aksoy B, Ateş Sönmezoğlu Ö (2022). Comparison of modified DNA isolation methods for the detection of GMO in processed foods. International Journal of Life Sciences and Biotechnology 5: 546-561.
22. Terzi Aksoy B, Sattuf A, Ateş Sönmezoğlu Ö (2024). Comparison of DNA isolation methods for GMO detection from biscuit samples. Anatolian Journal of Botany 8: 168-175.
23. Ünsal Sapan T, Acarkan E, Sandıkçı N (2025). Determination of efficient DNA recovery method in Pyracantha coccinea for use in forensic botany. Anatolian Journal of Botany 9: 6-10.
24. Wang Z, Li S, Ge S, Lin S (2020). Review of distribution, extraction methods, and health benefits of bound phenolics in food plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry 68(11): 3330-3343.