The Effect of Washing After Protein Blocking on Immunohistochemical Staining Applied to Paraffin Sections

Öz

Aim: Immunohistochemistry is still frequently preferred in both diagnostic and experimental studies because it can show proteins where they are in the tissue. One of the main problems in immunohistochemistry is the background staining, which can be prevented by protein blocking and which occurs as a result of binding of primary antibodies to tissue proteins and Fc receptors in the tissue due to antigenic similarity. There is no consensus on whether to wash after protein blocking in current publications and immunohistochemistry manuals published by manufacturers. Material and Methods: In our study, routine immunohistochemistry procedure was applied to determine the expression of TNF-α on 5 μm thick sections obtained from rat gastric tissue samples in which an experimental gastric ulcer model was created with ethanol, and two groups were formed, with and without washing after protein blocking, with 10 sections in each group. For semi-quantitative evaluation, the histological score (h-score) was calculated from the images obtained from the immunohistochemically stained preparations of both groups and the obtained data were statistically compared. Results: As a result of our study, no statistically significant difference was found between the h-score values of the groups that were washed after protein blocking in immunohistochemical staining and the groups that did not wash (p=0.971). The median (min-max) values of the groups with and without washing are 211 (179-244) and 215 (171-251), respectively. Conclusion: In the immunohistochemical staining procedure, washing after protein blocking does not change the staining intensity, does not create background staining, and does not affect the result of the h-score for semiquantitative evaluation. Similar studies are recommended for other species, tissue types and antigens.

Anahtar Kelimeler

• Immunohistochemistry
• Paraffin section
• Protein blocking
• Washing
• h-score

Parafin Kesitlere Uygulanan İmmünohistokimyasal Boyamada Protein Blokajı Sonrası Yıkama Yapılmasının Sonuca Etkisi

Öz

Amaç: İmmünohistokimya, proteinleri dokuda bulundukları yerde gösterebilmesi nedeniyle gerek tanısal gerek ise deneysel çalışmalarda günümüzde halen sıklıkla tercih edilmektedir. İmmünohistokimyada temel problemlerden biri de, protein bloklama yapılarak önlenebilen ve antijenik benzerlik nedeniyle doku proteinlerine ve dokudaki Fc reseptörlerine primer antikorların bağlanması sonucu ortaya çıkan zemin boyanmasıdır. Güncel yayınlarda ve üreticiler tarafından yayımlanan immünohistokimya el kitaplarında protein bloklama sonrası yıkama yapılıp yapılmaması konusunda fikir birliği yoktur. Gereç ve Yöntemler: Çalışmamızda etanol ile deneysel mide ülseri modeli oluşturulmuş sıçan mide doku örneklerinden elde edilen 5 μm kalınlığındaki kesitlere TNF-α ifadesini belirlemek amacıyla rutin immünohistokimya prosedürü uygulanmış ve her grupta kesit sayısı 10 olacak şekilde protein bloklama sonrası yıkama yapılan ve yapılmayan iki grup oluşturulmuştur. Her iki grubun immünohistokimyasal yöntemle boyanmış preparatlarından elde edilen görseller üzerinden semikantitatif değerlendirme amacıyla histolojik skor (h-skoru) çıkarılmış ve elde edilen veriler istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. Bulgular: Çalışmamızın sonucunda immünohistokimyasal boyamada protein bloklama sonrası yıkama yapılan grup ile yıkama yapılmayan grupların h-skor değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p=0,971). Yıkama yapılan ve yapılmayan gruplara ait medyan (min-maks) değerleri sırasıyla 211 (179-244) ve 215 (171-251)’dir. Sonuç: İmmünohistokimyasal boyama prosedüründe protein bloklama sonrası yıkama yapılması zemin boyanması oluşturmamakta ve semikantitatif değerlendirme için yapılan h-skoru sonucunu etkilememektedir. Diğer doku tipleri ve antijenler için de benzer çalışmalar yapılması önerilmektedir.

Anahtar Kelimeler

• İmmünohistokimya
• Parafin kesit
• Protein bloklama
• Yıkama
• h-skor

Kaynakça

1. 1. Ramos-Vara, J. A., Kiupel, M., Baszler, T., Bliven, L., Brodersen, B., Chelack, B., Czub, S., Del Piero, F., Dial, S., Ehrhart, E. J., Graham, T., Manning, L., Paulsen, D., Valli, V. E., West, K., & American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians Subcommittee on Standardization of Immunohistochemistry (2008). Suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 20(4), 393–413.
2. 2. PC Goodwin et al., Microscopy, Immuno-Histochemistry, Digital Imaging, and Quantitative Microscopy (2017) in Comparative Anatomy and Histology, PM Treuting et al., eds., Academic Press, 2017.
3. 3. Sukswai, N., & Khoury, J. D. (2019). Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Current hematologic malignancy reports, 14(5), 368–375.
4. 4. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., & Tiemann, M. (2011). Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific reports, 1, 28.